CAT#:JW-7-01089
低温运输和保存

透明质酸酶（EC.3.2.1.35）活性测定试剂盒（540nm分光光度法）

产品及特点
透明质酸酶（Hyaluronidase，HAase）是一类在动物组织和细菌中广泛存在的酶。其中动物源性的透明质酸酶（EC3.2.1.35）水解透明质酸的b-1-4-糖苷键，产生还原性N-乙酰-D-葡萄糖胺；水蛭源性的透明质酸酶（EC3.2.1.36）水解透明质酸的b-1-3-糖苷键，产生还原性葡萄糖醛酸；细菌源性的透明质酸酶（EC4.2.2.1）裂解（非水解）透明质酸糖链中的b-1-4-糖苷键，生成饱和二糖。三种透明质酸酶酶切透明质酸分子的位置分别如下图的1（b-1-4-糖苷键）和2（b-1-3-糖苷键）所示：

本产品的原理是透明质酸酶（EC3.2.1.35）能产生还原性N-乙酰-D-葡萄糖胺，而后者在适当的条件下，可以和底物反应产生在540nm有光吸收的物质，通过检测这些物质而测定透明质酸酶的活性。本产品有如下特点：
1.即开即用，用户不用单独准备各种试剂。
2.操作简单快捷。
3.专一性强，只能检测动物源性的透明质酸酶（EC3.2.1.35），不能检测另外两种透明质酸酶。
4.提供还原糖标准品。
5.所能检测的线性范围在50-500U/mL之间。
6.适用于检测天然和重组透明质酸酶检测。
7.本试剂盒足够100次微量测定，每次可以测定0.5mL待测样本或标准品。
8.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品使用小扁盒包装
成份                                                       编号      规格        包装
透明质酸酶底物                               7-01089a    50mL    60 mL本色瓶
透明质酸酶底物显色液                   7-01089b     80mL    120 mL本色瓶
还原糖标准品母液（10mg/mL）    7-01089c     15mL    15 mL本色瓶
使用手册                                        7-01089sc    1份           无

运输及保存
低温运输，2-8℃保存，有效期一年。

自备物品
待测样本、样本悬浮缓冲液（如果不详，可用PBS）、分光光度计，1mL比色皿

使用方法
一、制作还原糖标准曲线样本
1.分别标记7个1.5mL塑料离心管1-7号。
2.在7号管中加入2.6mL缓冲液（用户重悬测试样本所用的溶液，如果不详则用PBS替代。下同），1.4mL 还原糖标准品母液(10mg/mL)，共4mL，涡旋震荡混匀，得到终浓度为3500ug/mL的7号液。
3.在6号管中加入0.5mL缓冲液，3mL 7号液，共3.5mL，涡旋震荡混匀，得到终浓度为3000ug/mL的6号液。
4.在5号管中加入0.5mL缓冲液，2.5mL 6号液，共3mL，涡旋震荡混匀，得到终浓度为2500ug/mL的5号液。
5.在4号管中加入0.5mL缓冲液，2mL 5号液，共2.5mL，涡旋震荡混匀，得到终浓度为2000ug/mL的4号液。
6.在3号管中加入0.5mL缓冲液，1.5mL 4号液，共2mL，涡旋震荡混匀，得到终浓度为1500ug/mL的3号液。
7.在2号管中加入0.5mL缓冲液，1mL 3号液，共1.5mL，涡旋震荡混匀，得到终浓度为1000ug/mL的2号液。
8.在1号管中加入0.5mL缓冲液，0.5mL上2号液，共1mL，涡旋震荡混匀，得到终浓度为500ug/mL的1号液。
9.上述1-7号标准曲线样本放冰上待用。没有用完的不需要保存。

二、酶切时生产还原糖
10.标记N+1个1.5mL的塑料离心管，其中N个用于待测样品，1个用于阴性对照。
11.按下表加入各成分：
                                    N个样品管        阴性对照管
透明质酸酶底物                各0.5mL        0.5mL
N个待测样品（含酶）      各0.5mL        不加
自备缓冲液或PBS            不加               0.5mL
12.37℃保温30分钟。
13.将离心管放沸水中5分钟。此步可以灭活反应管中的透明质酸酶。
14.常温14000g离心5分钟沉淀蛋白成分。
15.将400uL上清转移到新的1.5mL塑料离心管中待用，共N+1个管。

三、OD540测定还原糖浓度
16.上步得到的N+1个管（每管有0.4mL酶切产物）可以直接使用，另外再标记1-7号7个管，用于还原糖标准曲线制备。
17.在N+1+7个管中分别加入：
                           N个样品管        阴性对照管    1-7号标曲管
N+1个待测样品
不需要加        已各含0.4mL        已各含0.4mL    不加
1-7号
还原糖标准品    不加                   不加                各0.4mL（1号到1号管，2号到2号管……）
还原糖显色液    各0.8mL            0.8mL            各0.8mL
18.将离心管放沸水中5分钟以显色。
19.冷却到室温后迅速用分光光度计在540nm测定OD，测前用蒸馏水调零。
20.得到的OD分别减去阴性对照的OD即得N个样本的OD和7个标准曲线样本的OD。

三、数据分析
21.以还原糖浓度为横轴，以OD540为纵轴，以1-7号还原糖标准曲线样本的数据用excel绘制标准曲线并得到计算公式。
22.根据计算公式，用N个样本的OD540数据计算出其所对应的还原糖浓度。根据透明质酸酶活性的定义（每分钟降解透明质酸后形成1umol还原糖所需要的酶量为1个单位）计算出酶的活性。本测试所用还原糖的分子量为XXX。

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