CAT#:JW-7-01146
低温运输，-20℃保存

NADPH含量测定试剂盒（G6PDH-分光光度法）

产品及特点
本产品是一种通过比色法来测定细胞、组织或其它样品中NADP+ (NADP+)和NADP+ (NADPH)含量、比值和总量的检测试剂盒。其原理测定NADP+/NADP+总量的原理是：葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate, G6P)在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH)的作用下氧化生成6-磷酸葡萄糖酸内酯(6-phosphogluconate, 6-PG)，同时NADP+被还原为NADPH；生成的NADPH在电子耦合试剂1-mPMS (1-Methoxy-5-methylphenazinium Methyl Sulfate)的作用下将WST-8还原生成橙黄色的甲臜formazan，反应体系中生成的甲臜与样品中NADP+和NADPH的总量相关，因此通过测定甲臜的浓度可以推测NADP+和NADPH的总量。如果将样本在60ºC水浴加热30分钟将NADP+分解，则测定的只是NADPH的量，通过总量减去NADPH就得到NADP+的量，就可以计算得到NADP+/NADPH的比值。本反应原理图如下：

本产品具有下列特点：
1.使用便捷，只需要细胞裂解液，无需分离纯化细胞、组织或其它样品中的NADP+/NADPH。
2.特异性强，只检测NADP+/NADPH，不能检测其其他辅酶，如NAD+和NADH。
3.最低检测量0.05mM(2.5pmol)的NADP+或NADPH。
4.在0.05 mM (2.5pmol)至6 mM(300pmol)之间呈现良好的线性关系。
5.适用于检测细胞、组织以及其它适当样品中的NADP+和NADPH各自的量、比值和总量。
6.可以进行100次NADP+和NADPH总量或者NADPH含量检测；可以进行50次NADP+/NADPH比值的检测。每次检测50uL样本。
7.本试剂盒采用96孔板检测，1个孔的检测表示1次。
8.用WST-8替代老版本的MTT，故形成的甲臜是水溶性，不容易沉淀，并且。再次，WST-8比XTT和MTS更加稳定，使实验结果更加稳定。
9.本产品只可用于科研。

规格及成分
成份                                   编号           规格            包装
提取液                               7-01146a    50 mL    60 mL本色瓶
反应缓冲液                        7-01146b    11 mL    15 mL本色瓶
G6PDH
（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）   7-01146c    220 mL    0.5 mL红盖管
WST-8显色液                      7-01146d    1.1 mL    1.5 mL棕色管
NADPH干粉                        7-01146e    5 mg        10 mL棕色瓶
使用手册                             7-01146sc    1份            无
本产品采用小扁盒包装

运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期一年，避免反复冻融。WST-8显色液和NADPH干粉须-20ºC避光保存。

自备试剂
待测样品，PBS，超纯水，96孔板，450nm分光光度计。

使用方法
一、待测样品的准备
1.培养细胞样品：对贴壁细胞，首次测试时，使用1×10E6个贴壁细胞 (大约相当于6孔板一个孔长满的细胞数量)，吸净培养基，用移液器加入200 mL的提取液，并轻轻吹打裂解细胞；对悬浮细胞，首次测试时，使用1×10E6个细胞，600g离心5分钟，吸净培养基，用移液器加入200 mL冰浴预冷的提取液，并轻轻吹打裂解细胞（室温或冰上操作均可），12,000g 4ºC离心10分钟，取上清作为待测样品备用。
2.实体组织样品：用预冷的PBS洗涤实体组织，称取约10-30 mg用剪刀剪碎，置于匀浆器中，加入400 mL的提取液在室温或冰上进行匀浆。随后12,000g 4ºC离心10分钟，取上清作为待测样品备用。
3.首次测试如果发现总量过低，则需要在后续测试中加大细胞或组织的用量。

二、试剂盒的准备
4.NADPH标准品的配制：将6 mL自备超纯水加入到本试剂盒提供的5 mg NADPH后即得到1 mM的NADPH标准品，根据每次需要量分装，留下实验需要的后，把剩余的全部放80ºC避光保存。
5.NADPH标准曲线的设置：把1 mM的NADPH标准品用提取液稀释成0、0.25、0.5、1、2、4、6、8 mM这8个浓度，每个浓度取50 mL在96孔板中进行检测，相当于每孔NADPH的量分别为0、12.5、25、 50、100、200、300、400 pmol。如有必要，在后续的实验中可以根据样品中NADPH含量对标准品的浓度范围进行适当调整。其中浓度为0 mM的点为空白对照点，仅含提取液。注意：由于NADPH很不稳定，故配制后需尽快使用。
6.G6PDH工作液的配制：将G6PDH用反应缓冲液稀释50倍，如2 mL G6PDH加入到98 mL的反应缓冲液中。注意：每个标准品或样品的检测需要使用100 mL的G6PDH工作液，请根据所需检测的标准品和样品的数量，配制适量的G6PDH工作液，并注意现配现用。

三、样品测定
7.如果测定样品中NADP+和NADPH的总量：立即进入第9步。
8.如果测定样品中NADP+、NADPH的含量或者两者的比值：吸取100-200 mL待测样品于离心管中，60ºC加热30分钟，10,000g室温离心5分钟，立即进入第9步。
9.按下表设置反应：
                               1-8标准品管（含空白对照）    N个样品管
8个浓度的标准品            各50 mL                               -
N个待测样品                       -                                    各50 mL
G6PDH工作液                100 mL                            100 mL
合计                                150 mL                            150mL
注意：在加入G6PDH工作液过程中须轻柔操作，以免产生气泡。
10.37ºC避光孵育10分钟。
11.适当混匀WST-8显色液，然后每孔加入10 mL，混匀，37ºC避光孵育10-20分钟，此时会形成橙黄色的甲臜。
12.测量450nm处的吸光度。如果显色较浅，也可以适当延长孵育时间至30-60分钟，随着孵育时间延长，显色会逐渐加深。
四、数据分析
13.计算标准品组中每个点的平均吸光度，减去空白对照管的吸光度，即为各个标准品的吸光度。
14.以NADPH的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线。如果孵育时间过长，高浓度标准品的显色会达到平台，此时宜选择未达到平台的标准品来绘制标准曲线，或者选择孵育时间较短的标准品吸光度数据来绘制标准曲线。
15.根据标准曲线计算细胞、组织等样品中的NADP+和NADPH总浓度或者NADPH的浓度。如果样本经过60ºC加热处理，计算得到的是样品中NADPH的浓度。
16.根据如下公式计算样品中NADP+的量以及NADP+/NADPH的比值。
[NADP+] = [NADP total] - [NADPH] [NADP+ ]/[NADPH]
= ([NADP total] - [NADPH])/[NADPH]
17.此时可以把NADP+和NADPH总量或各自的含量用单位细胞数量或单位组织重量中的含量来表示。如果希望更加精确地来表述NADP+和NADPH总量或各自的含量，可以将样品用BCA法测定蛋白浓度。最终用单位蛋白量中NADP+和NADPH总量或各自的含量来比较精确地进行表述。
18.如果样品溶液中NADP+和NADPH浓度过高或过低，不在试剂盒的线性检测范围内时，可适当调整样品或者提取液的用量。

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