CAT#:JW-7-EC3.2.1.17-GB
低温运输和保存

溶菌酶活性测定试剂盒（国标法）

产品及特点
溶菌酶（Lysozyme，LZM，EC3.2.1.17）又叫胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，它能催化细菌细胞壁多糖的水解，从而溶解细菌的细胞壁，起到杀死细菌的作用。溶菌酶广泛存在于人体、动物、植物和微生物中，因此溶菌酶活性具有重要的意义。本公司根据现行国标GB/T30990-2014的方法开发了本产品，其原理是利用溶菌酶可水解溶壁微球菌（Micrcoccus lysodikticus）的细胞壁导致菌悬液的浊度降低，继而导致450nm吸光光度值的变化来测定酶活力。本产品的特点如下：
1.即开即用，用户不用单独准备各种试剂，操作简单。
2.根据国标GB/T30990-2014设计。
3.本试剂盒1个溶菌酶活性单位的定义是在25℃，每分钟使450nm吸光度值减少0.001的酶量。
4.适用于检测动植物、微生物和培养细胞样品中的溶菌酶活性。
5.本产品足够100次溶菌酶活性检测实验。
6.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品使用小扁盒包装
成份                                                    编号                      规格           包装
溶菌酶活性测定底物重悬液    7-EC3.2.1.17-GBa    125 mL×3    125mL本色瓶
溶菌酶活性测定底物干粉       7-EC3.2.1.17-GBb    100mg            5 mL棕玻瓶
使用手册                                7-EC3.2.1.17-GBsc    1份                   无

运输及保存
低温运输，溶菌酶活性测定底物稀释液和溶菌酶活性测定底物干粉4℃保存，有效期一年。

自备物品
蒸馏水、分光光度计、玻璃比色皿（光径1cm）、可调式移液器、水浴锅/恒温培养箱。

使用方法
一、待测样本制备:
1.液体样品的：澄清的液体可以直接检测，若浑浊则可以离心后取上清液直接检测。为了计算酶的比活，需要用自备方法测定待测样本总蛋白浓度。
2.组织样本：取约0.1g组织，加入1mL生理盐水，进行冰浴匀浆。4℃12000rpm离心10分钟，取上清，置冰上待测。为了计算酶的比活，需要用自备方法测定待测样本总蛋白浓度。

二、测定步骤
1.分光光度计预热30分钟以上，设定温度25℃，调节波长至450nm处，用自备的蒸馏水调零。
2.在预热期间，新鲜配置溶菌酶活性检测底物工作液（以下简称底物工作液）。先根据待测样本数计算出所需底物工作液的体积（每个样本需要2.5mL，则N个样本则需要2.5 mL×（2N+2））。下面以制备20mL底物工作液为例：小心称取10mg底物干粉到适当塑料瓶中，加入20mL溶菌酶活性测定底物重悬液（以下简称底物重悬液）后，涡旋振荡至底物干粉全部重悬，测定A450nm。再用底物重悬液将其稀释到A450nm为0.7，此溶液即为底物工作液，放25℃预热待用。同时需要将底物重悬液放25℃预热待用。
3.在预热期间，配制待测样品。用底物重悬液稀释待测样品至适当浓度，放冰上待用（为避免残留蛋白酶的降解，最好不要25℃预热待用）。最适浓度为能使反应体系每分钟A450nm降低0.02-0.04的浓度。首次测定不知道最适浓度时，可以先预实验，把样本稀释到不同的浓度同时测定，确定最适浓度范围。
4.如果有N个待测样本，每个样本做两个平行测试，则准备2N+2只试管，多出的两只为空白。在25℃恒温条件下，按下表操作步骤加入各试剂，反应总体积为3mL。
试剂                                   2个空白管        2N个样品管
25℃预热的底物工作液    2.5 mL               各2.5 mL
25℃预热的底物重悬液    0.5 mL               不加
N个待测样品                        不加               各0.5 mL
5.加入0.5mL待测样本后，迅速混匀，然后取3mL加入到比色皿中，每隔30秒读取吸光度值（A），共读3分钟。以A对时间作图，取反应最初线性部分，计算出每分钟A的减少值（△A/分钟）为ΔA450nm/分钟=ΔA样品/分钟-ΔA空白/分钟。
6.溶菌酶总活性计算：
由于1个溶菌酶活性单位定义为在25℃，每分钟使450nm吸光度值减少0.001的酶量，故待测样本含有的溶菌酶总活性单位=ΔA450nm/分钟÷0.001。
7.溶菌酶比活性计算：
待测样本的溶菌酶比活性=待测样本中溶菌酶的总活性单位÷待测样本总蛋白量，总蛋白量=待测样本蛋白浓度（第1和第2步）×待测样本体积0.5mL。

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