CAT#:JW-6-3170
低温运输，-20℃保存

原生质体制备缓冲液（酵母专用）

产品及特点
本产品是含EDTA、β-巯基乙醇、酵母细胞壁溶解酶等组分的混合液，可用于酵母原生质体的制备。其原理是通过酶的作用使细胞壁降解从而释放原生质体，特点如下：
1.即开即用，无需客户配置溶液。
2.操作简单，无有毒物质。
3.本产品可进行25次酵母原生质体制备，每次处理200mL OD值为0.2-0.3的酵母培养液。
4.本产品制备所得酵母原生质体可直接用于后续转化实验。
5.本产品仅应用于科研。

规格及成分
本产品使用立盒包装
成分                                           编号          规格        包装
原生质体制备缓冲液成份A    6-3170a       250 mL    250mL本色瓶
原生质体制备缓冲液成份B    6-3170b       25 mg    1.5mL本色管
使用手册                                  6-3170sc    1份       无

运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备物品
无菌水，EDTA-Na2(10mM)，1M山梨醇
使用方法
1.称取1mg原生质体制备缓冲液成份B加入到5mL原生质体制备缓冲液成份A中充分混匀形成原生质体制备缓冲液备用；本试剂需要现配现用。
2.平板培养酵母菌后挑取单菌落至200mL YPD液体培养基中进行摇菌培养，检测菌液OD600在0.2-0.3时停止培养。
3.将上步所得菌液转移至50mL离心管中，5000×g离心5-10分钟，弃掉上清液，收集酵母沉淀。
4.在上步所得酵母沉淀中加入20mL无菌水，震荡混匀后将此溶液转移至无菌50mL离心管中，室温1500×g离心5分钟，弃掉上清保留酵母细胞沉淀。
5.在上步所得酵母细胞沉淀中加入20mL EDTA-Na2(10mM)洗涤酵母细胞沉淀，室温静置10分钟后1500×g离心5分钟，弃掉上清保留沉淀。
6.在上步所得沉淀中加入5mL原生质体制备缓冲液成份A重悬酵母细胞沉淀，重悬后加入5mL第一步所得原生质体制备缓冲液，颠倒混匀后35℃轻微振荡进行原生质体制备，保温15-40分钟，具体以原生质体生成率大于70%为宜。原生质体生成率计算方式如下：
原生质体生成率=100-[(制备结束OD800/初始OD800)×100]
例：制备结束OD800=0.032；初始OD800=0.256
原生质体生成率=100-[(0.032/0.256)×100]
原生质体生成率=100-(0.125×100)
原生质体生成率=100-12.5
原生质体生成率=87.5%
7.750×g离心10分钟，弃上清，收集酵母原生质体沉淀。
8.向上步所得沉淀中加入10mL 1M山梨醇洗涤酵母原生质体，无需震荡混匀，轻轻敲击管壁使酵母原生质体沉淀和山梨醇充分混匀即可。
9.750×g离心10分钟，弃上清后收集沉淀，即得到酵母原生质体样品。

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