CAT#:JW-6-1516
低温运输，-20℃保存

1×原位杂交液

产品及特点
原位杂交（In Situ Hybridization，ISH）是在一定生物结构基础之上的核酸杂交。这种结构基础可以是一条染色体，一个细菌，更大结构基础是细胞和组织。基本原理是两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA双键分子，应用带有标记的（有放射性同位素，如3H、35S、32P、荧光素生物素、地高辛等非放射性物质）DNA或RNA片段作为核酸探针，与组织切片或细胞内待测核酸（RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在并定位。本产品就是用于原位杂交的杂交液。它有下列特点：
1.即开即用，不用用户自己购买原料配制和优化配方。
2.有很高的敏感性和特异性（跟探针设计，杂交温度等密切相关）。
3.既可以用于RNA原位杂交、DNA原位杂交，也可以用于荧光原位杂交（FISH）。
4.如果使用Oligo探针进行原位杂交，则需要购买另外的产品：核酸杂交液（Oligo探针专用）。

规格及成分
本产品用塑料袋包装
成分                        编号    规格       包装
1×原位杂交液    6-1516    10 mL    10 mL本色瓶
使用手册        6-1516sc    1份       1份

运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂
盖玻片、多聚甲醛、PBS、蒸馏水及相关实验试剂及耗材

使用方法
以检测mRNA序列的切片原位杂交为例：
一、培养细胞和冰冻切片的原位杂交
1.玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES处理拨片。切片厚度10-20 μm。
2.细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1 M PBS(PH 7.4)洗2分钟×3次。
3.培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：用4%多聚甲醛固定液（0.1 M RNase-free PBS，pH 7.2-7.6）室温固定30分钟，用蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4.将30%H2O2和纯甲醇按1：50的比例混合，然后用此混合液室温处理细胞30分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗涤3次。
5.暴露mRNA核酸片段：在切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1 mL 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化0.5-2分钟。
6.用PBS洗3次，每次5分钟，蒸馏水洗1次。
7.用4%多聚甲醛固定液（0.1 M RNase-free PBS，pH 7.2-7.6）在室温固定10分钟，然后蒸馏水洗涤3次

注意：如果使用胃蛋白酶消化才需要再固定这一步。
8.预杂交：在杂交盒底部加20%甘油20 mL以保持湿度。按每张切片加20 μL预杂交液。恒温箱38-42℃放置2-4小时。吸弃多余杂交液，不用洗切片。
9.靶分子的变性：将探针溶液加到切片上，盖上盖玻片，80℃烘箱变放置10 min，冷却至37℃后进入下一步

注意：靶分子为mRNA，故可以跳过此步，如果为DNA的则必须变性。
10.杂交：每张切片加20 μL核酸杂交液（原位杂交专用），盖上原位杂交专用盖玻片，放恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。   
11.杂交后洗涤：揭掉盖玻片，用37℃预热的2×SSC洗涤2次，每次5分钟；37℃ 0.5×SSC洗涤15分钟；37℃ 0.2×SSC洗涤15分钟（如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次）。
12.滴加封闭液，37℃放置30分钟。甩去多余封闭液，不洗。
13.根据探针标记物，选择相应显色方法显色、复染，脱水、封片。
14.结果观察。

石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液选择4%多聚甲醛（0.1 M PBS，pH 7.0-7.6）。标本较大时用刀片切成厚度不超过4 mm的小块，固定1小时即可。较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
15.常规脱水、浸蜡、包埋、切片。切片厚度在6-8 μm。
16.玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES预先处理。
17.石蜡切片经常规脱蜡至水。将30%H2O2 和蒸馏水的1：10混合液加到切片上，室温放置10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
18.暴露mRNA核酸片段：在切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1 mL 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化3-30分钟（视标本新旧、厚薄自行调整）。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到最佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
19.其余步骤同冰冻切片（第1节第6-11步相同）。

关联产品
核酸杂交液（Oligo探针）