CAT#:JW-15-rs1801133
低温运输，-20℃保存

人MTHFR基因677C>T点突变探针法qPCR检测试剂盒

产品及特点
MTHFR是甲基四氢叶酸还原酶（Methylenetetrahydrofolate Reductase），它的基因位于人类染色体1号上，是一种重要的酶参与体内甲基化反应和嘌呤核苷酸的生物合成。MTHFR基因中存在一些常见的多态性位点，其中就有677C>T点突变。些变异可能会影响MTHFR酶的活性，进而影响体内甲基化反应和DNA甲基化。MTHFR基因变异已与多种疾病的风险增加相关，如神经管缺陷、心血管疾病、某些癌症等，严重危害了人类的健康。因此研究677C>T突变具有重要的研究意义，为此本公司开发了专门检测677C>T突变的探针法qPCR检测试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到1000拷贝/μL。
3.分辨率高，能检测出5%的点突变。
4.一管式检测，野生型探针用FAM标记，突变型探针用Cy5标记。
5.同时提供野生型和突变型两种阳性对照，便于排除假阴性样品。
6.特异性高，引物和探针是根据人MTHFR基因677C>T突变设计，不会跟其他突变发生交叉反应。
7.本产品只能定性，不能定量。
8.本产品足够50次20 μL体系的点突变探针法荧光定量PCR反应。
9.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品采用5孔盒包装
成分                                    编号        规格    包装
2×点突变Probe
 qPCR MasterMix            190303        0.5 mL    0.5 mL本色盖
超纯水                             210806        1 mL    1.5 mL蓝盖管
人MTHFR基因rs1801133位点检测引物-探针混合液干粉    yp15- rs1801133    50次    0.5 mL白盖管
人MTHFR基因 21号外显子
野生型阳性对照
(1E4拷贝/μL)        pc001MTHFR-ex21    250 μL    1.5 mL棕色管
人MTHFR基因rs1801133位点突变型阳性对照(1E4拷贝/μL)    pc15- rs1801133    250 μL    0.5 mL黄盖管
使用手册                15-rs1801133sc    1份        无
注意：使用前需要在引物探针干粉管中加入160 μL的自备超纯水，震荡混匀后再取用一次没用完剩下的需要放-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂
样品DNA。

使用方法
一、样品DNA的制备
1.如果有N个样品，则进行N次纯化，得到的DNA最后溶解在TE中，并需要用NanoDrop进行定量。最后的浓度不能低于0.2ug/μL。
2.本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。

三、点突变Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
3.如果只做1次重复，则标记N+3个PCR管，其中N个用于上步得到的N样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板，NC），3个用于阳性对照（PC）。
4.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加）：
成分                       样品管N个    扩增NC        野生型PC        杂合型PC        突变型PC
2×点突变Probe
qPCR MasterMix    各10 μL        10 μL            10 μL                10 μL               10 μL
人MTHFR基因rs1801133位点检测引物-探针混合液    各4 μL    4 μL    4 μL    4 μL    4 μL
 N个DNA样本        各3 μL                
超纯水                   各3 μL            6 μL            3 μL                                        3 μL
人MTHFR基因 21号外显子
野生型阳性对照(1E4拷贝/μL)                3 μL        3 μL    
人MTHFR基因rs1801133位点突变型阳性对照(1E4拷贝/μL)                3 μL        3 μL
5.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
过程                   温度    时间
预变性               95℃    90 sec
PCR反应
（45个循环）    95℃    15 sec
                          60℃    60 sec（采集FAM和Cy5通道的荧光信号，淬灭基团均为TAMRA）

五、数据处理
6.实验有效性的判断：首先分析扩增NC是否有FAM或/和Cy5信号，如果有则表示实验污染，本次实验无效，无需分析所有实验数据，需要寻找原因。如果无则表示实验没有污染，再分析三个PC。如果野生型PC没有FAM扩增信号（有标准的倒S扩增曲线，下同），或突变型PC没有Cy5扩增信号，或杂合型PC没有FAM和Cy5扩增信号，则表示实验无效，不需要分析样本的数据，需要分析原因。如果三个PC正常（野生型PC有FAM扩增信号，突变型PC有Cy5扩增信号，杂合型PC有FAM和Cy5扩增信号），则实验有效，可以分析样本的数据。
7.如果荧光定量PCR仪有基因分型的自动分析模块，则进入该模块，获得每个样本的Cy5值/FAM值的荧光比值，并根据荧光比值描出散点图。荧光比值位于散点图的X轴方向的样本可以判为突变型，荧光比值将位于Y轴方向的样本可以判为野生型，荧光比值位于X轴和Y轴中间的可以判为杂合子。扩增NC的荧光比值将位于原点附近。散点图的示例如下：

8.如果荧光定量PCR仪没有基因分型的自动分析模块，则需要手动分析。首先根据Ct值判断每个样本在FAM和Cy5两个通道的扩增情况。如果FAM通道的Ct低于35，则算FAM信号有扩增。如果Ct大于35或没有Ct，则算FAM通道无扩增。Cy5通道也如此操作。然后根据扩增结果按下表判断每个样本的基因型，得到无效数据的样本需要重复：
FAM通道    Cy5通道    基因型判断
有扩增        无扩增        野生型
有扩增        有扩增        杂合子
无扩增        有扩增        突变型
无扩增        无扩增        阴性PC或无效数据

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