CAT#:JW-15-39500
低温运输，-20℃保存

致泻性大肠杆菌探针法qPCR试剂盒

产品及特点
能够引起肠道内急性腹泻的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌(Diarrheagenic Escherichia coli，DEC，致泻性大肠埃希氏菌)。我国发生的食物中毒事件中，细菌性食物中毒的人数最多，占总中毒人数的42.8％，致泻性大肠杆菌根据其毒力因子、致病机理和流行病学特征可分为5类，分别是肠道聚集性大肠杆菌 (Enteroaggregative Escherichia coli， EAEC)、肠道致病性大肠杆菌(Enteropathogenic Escherichia coli，EPEC) 、肠道侵袭性大肠杆菌 (Enteroinvasive Escherichia coli，EIEC) 、产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC)或称为肠道出血性大肠杆菌 (Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)、产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC) ，因此快速检测和对致泻性大肠杆菌进行分型具有重要意义。本产品就是为满足此需求的探针法PCR试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/反应。
3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4.特异性高，引物是根据致泻性大肠杆菌DNA高度保守区设计，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。
5.可以用于分型，两管式扩增，一次能区分5种致泻性大肠杆菌。
6.本产品主要用于定量检测和分型，不建议用于定量。分型后可以再另购定量试剂盒。
7.本产品足够50次20μL体系的探针法qPCR反应。
8.本产品只能用于科研。

规格及成分
成分                                            编号                规格            包装
2×Probe qPCR MasterMix     981201               0.5 mL    0.5 mL本色盖
荧光PCR专用模板稀释液      180701                1 mL      1.5 mL绿色盖
超纯水                                    210806                1 mL     1.5 mL蓝色盖
三重致泻性大肠杆菌探针法qPCR引物-探针混合液干粉
（EAEC、EPEC、EIEC）    yp15-39500pt1    50次    0.5 mL棕色盖
双重致泻性大肠杆菌探针法qPCR引物-探针混合液干粉
（STEC、ETEC）                yp15-39500pt2    50次    0.5 mL棕色盖
致泻性大肠杆菌探针法qPCR
阳性对照(1×10E4拷贝/μL)    pc15-39500     250 μL    0.5 mL黄色盖
使用手册                              15-39500sc           1份            无
本产品使用五孔盒包装

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂
样品DNA。

使用方法
一、样品DNA的制备
1.如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL试剂盒提供的阳性对照再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为样本制备的PC。另外用水作为样本制备的NC。
2.用自选方法纯化样品的DNA。本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的核酸纯化试剂盒。

二、设置三重Probe qPCR反应（20μL体系）
3.如果每个样本只做1次重复，则需要标记N+4个PCR管，其中N+2个管用于N+2个样本，另外1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（直接用试剂盒提供的阳性对照做模板）。分别在各管加入：
成分                                                    样品管N+2个    PCR阴性对照    PCR阳性对照
2×Probe qPCR MasterMix                   各10 μL               10 μL                10 μL
三重致泻性大肠杆菌探针法qPCR引物-探针混合液
（EAEC、EPEC、EIEC）                    各3 μL                3 μL                 3 μL
 N+2个待测DNA样本                             各7 μL                不加                不加
超纯水                                                    不加                   7 μL                不加
致泻性大肠杆菌探针法qPCR
阳性对照(1×10E4拷贝/μL)                     不加                    不加                 7μL

三、设置双重Probe qPCR反应（20μL体系）
4.如果每个样本只做1次重复，则需要标记N+4个PCR管，其中N+2个管用于N+2个样本，另外1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（直接用试剂盒提供的阳性对照做模板）。分别在各管加入：
成分                                                    样品管N+2个    PCR阴性对照    PCR阳性对照
2×Probe qPCR MasterMix                   各10 μL               10 μL                10 μL
双重致泻性大肠杆菌探针法qPCR引物-探针混合液
（EAEC、EPEC、EIEC）                    各3 μL                3 μL                 3 μL
 N+2个待测DNA样本                              各7 μL                不加               不加
超纯水                                                    不加                    7 μL               不加
致泻性大肠杆菌探针法qPCR
阳性对照(1×10E4拷贝/μL)                    不加                       不加               7μL
四、Probe qPCR反应（20μL体系）
5.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
过程                   温度    时间
预变性                95℃    10 min
PCR反应
（45个循环）    95℃    10 sec
                          60℃    60 sec（采集FAM、HEX、Texas Red三个通道的荧光信号，设置TAMRA为淬灭基团）

四、数据处理
6.阴性对照Ct必须没有数值，等于或者大于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于40。如果不符合上述要求，则整个实验无效，需要重做或者跟厂家联系。
7.如果对照合格，则实验有效，可以分析待测样本。
8.对待测样本，如果其所对应的荧光信号的Ct小于40则为阳性。如果没有Ct值，或大于或等于40则为阴性。
PCR    对应病原    荧光通道
三重PCR    EAEC     FAM
    EPEC     HEX
     EIEC     Texas Red
双重PCR    STEC     FAM
    ETEC     HEX

关联产品
致泻性大肠杆菌染料法qPCR试剂盒