CAT#:JW-15-rs113488022
低温运输，-20℃保存

人BRAF基因c.1799T>A(V600E)点突变探针法qPCR检测试剂盒

产品及特点
BRAF基因位于人7号染色体上，该基因编码RAF家族丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。该基因编码的蛋白在调节MAPK/ERK信号通路中起作用，影响细胞分裂，分化和分泌。BRAF基因最常见的突变为1799T>A（V600E），常在黑色素瘤，非霍奇金淋巴瘤，大肠癌等肿瘤疾病中发生突变。人BRAF基因的15号外显子1799T>A（V600E）点突变与多种肿瘤疾病有关，因此研究1799T>A突变具有重要的研究意义，为此本公司开发了专门检测1799T>A突变的探针法qPCR检测试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到1000 拷贝/μL。
3.分辨率高，能检测出5 %的点突变。
4.一管式检测，突变型探针用FAM标记，野生型探针用Cy5标记。
5.同时提供野生型和突变型两种阳性对照，便于排除假阴性样品。
6.特异性高，引物和探针是根据人BRAF基因1799T>A突变设计，不会跟其他突变发生交叉反应。
7.本产品只能定性，不能定量。
8.本产品足够50次20 μL体系的点突变探针法荧光定量PCR反应。
9.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品采用5孔盒包装
成分                                                  编号               规格       包装
2×SNP ProbeqPCR MasterMix     231222           0.5 mL    0.5 mL本色盖
超纯水                                            210806          1 mL       1.5 mL蓝盖管
人BRAF基因rs113488022位点
检测引物-探针干粉    ywpb15-rs113488022          50 次    0.5 mL白盖管
人BRAF基因15号外显子
野生型阳性对照(1E4拷贝/μL)    pc-rs113488022wt    250 μL    1.5 mL棕色管
人BRAF基因rs113488022位点突变型
阳性对照(1E4拷贝/μL)            pc-rs113488022mt    250 μL    0.5 mL黄盖管
使用手册                                15-rs113488022sc    1份    无
注意：使用前需要将引物探针干粉管短暂离心后加入220 μL的自备超纯水，震荡混匀后再取用，一次没用完剩下的需要放-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备物品
样品DNA。

使用方法
一、样品DNA的制备
1.如果有N个样品，则进行N次纯化，得到的DNA最后溶解在TE中，并需要用NanoDrop进行定量。最后的浓度不能低于0.2 μg/μL。
2.本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。

三、点突变Probe qPCR反应（20 μL体系，在样品制备室进行）
3.如果只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N个用于上步得到的N样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板，NC），3个用于阳性对照（PC）。
4.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加）：
成分                                            样品管N个    扩增NC    野生型PC    杂合型PC    突变型PC
2×SNP Probe qPCR MasterMix    各10 μL    10 μL        10 μL            10 μL           10 μL
rs113488022位点
检测引物-探针混合液                    各4 μL        4 μL           4 μL           4 μL               4 μL
N个DNA样本                                各3 μL                
超纯水                                           各3 μL        6 μL          3 μL                                   3 μL
人BRAF基因15号外显子
野生型阳性对照(1E4拷贝/μL)                                              3 μL            3 μL    
人BRAF基因rs113488022位点突变型
阳性对照(1E4拷贝/μL)                                                                           3 μL                3 μL
5.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
过程                温度    时间
预变性            95℃    90 sec
PCR反应
（45个循环） 95℃    15 sec
                       60℃    60 sec（采集FAM和Cy5通道的荧光信号，淬灭基团均为TAMRA）

五、数据处理
6.实验有效性的判断：首先分析扩增NC是否有FAM或/和Cy5信号，如果有则表示实验污染，本次实验无效，无需分析所有实验数据，需要寻找原因。如果无则表示实验没有污染，再分析三个PC。如果突变型PC没有FAM扩增信号（有标准的倒S扩增曲线，下同），或野生型PC没有Cy5扩增信号，或杂合型PC没有FAM和Cy5扩增信号，则表示实验无效，不需要分析样本的数据，需要分析原因。如果三个PC正常（突变型PC有FAM扩增信号，野生型PC有Cy5扩增信号，杂合型PC有FAM和Cy5扩增信号），则实验有效，可以分析样本的数据。
7.如果荧光定量PCR仪有基因分型的自动分析模块，则进入该模块，获得每个样本的FAM值/Cy5值的荧光比值，并根据荧光比值描出散点图。荧光比值位于散点图的X轴方向的样本可以判为突变型，荧光比值将位于Y轴方向的样本可以判为野生型，荧光比值位于X轴和Y轴中间的可以判为杂合子。扩增NC的荧光比值将位于原点附近。散点图的示例如下：

8.如果荧光定量PCR仪没有基因分型的自动分析模块，则需要手动分析。首先根据Ct值判断每个样本在FAM和Cy5两个通道的扩增情况。如果FAM通道的Ct低于35，则算FAM信号有扩增。如果Ct大于35或没有Ct，则算FAM通道无扩增。Cy5通道也如此操作。然后根据扩增结果按下表判断每个样本的基因型，得到无效数据的样本需要重复：
FAM通道    Cy5通道    基因型判断
有扩增        无扩增        突变型
有扩增        有扩增        杂合子
无扩增        有扩增        野生型
无扩增         无扩增       阴性PC或无效数据

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