CAT#:JW-15-rs121913530
低温运输，-20℃保存

人Kras基因c.34G>T(p.G12C)点突变探针法qPCR检测试剂盒

产品及特点
KRAS基因的全名叫Kirsten Rat Sarcoma Viral Oncogene Homolog，（Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物），它编码一种小GTP酶，该酶属于RAS超蛋白家族。KRAS基因位于1号染色体上。大约有30%的癌症患者都存在KRAS突变，其中包括90%的胰腺癌，50%的结肠癌和25%的肺癌。在非小细胞肺癌中，KRAS基因突变占20～30%，多存在于肺腺癌中，肺鳞癌中比较罕见。在KRAS突变类型中，c.34G>T(p.G12C)突变最常见，约占所有KRAS突变的44％，最常见的癌种是非小细胞肺癌，因此快速检测此突变具有重要的意义。为此本公司开发了简单快捷的检测该位点的点突变探针法qPCR检测试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到1000拷贝/μL。
3.能检测出5%的点突变。
4.提供两种阳性对照，便于区分假阴性样品。
5.特异性高，引物是根据人Kras基因rs121913530位点设计，不会跟其他位点的DNA发生交叉反应。
6.本产品只能定性，不能定量。
7.本产品足够50次20μL体系的点突变探针法荧光定量PCR反应。
8.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品采用5孔盒包装
成分                                                                                 编号                    规格            包装
2×点突变Probe qPCR MagicMix                                   190303                0.5 mL    0.5mL本色盖
超纯水                                                                            210806                1 mL      1.5mL蓝盖管
rs121913530位点检测引物-探针混合液干粉       ywpb15- rs121913530    50次      0.5mL白盖管
rs121913530位点GG阳性对照(1×10E4拷贝/μL)    pc15- rs121913530g    250 μL    1.5mL棕色管
rs121913530位点TT阳性对照(1×10E4拷贝/μL)     pc15- rs121913530c    250 μL    0.5mL黄盖管
使用手册                                                                    15-rs121913530sc    1份           无

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂
样品DNA。

使用方法
一、样品DNA的制备
1.如果有N个样品，则进行N次纯化，得到的DNA最后溶解在TE中，并需要用NanoDrop进行定量。最后的浓度不能低于0.2ug/μL。
2.本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。

三、点突变Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
3.如果只做1次重复，则标记N+3个PCR管，其中N个用于上步得到的N样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板，NC），3个用于阳性对照（分别对应两种纯合子基因型和一种杂合子基因型）。
4.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
成分                                                                样品管N个    NC      GG         GT        TT
2×点突变Probe qPCR MagicMix                     各10 μL      10 μL    10 μL    10 μL    10 μL
rs121913530位点检测引物-探针混合液            各4 μL       4 μL       4 μL      4 μL    4 μL
 N个DNA样本                                                    各3 μL                
超纯水                                                               各3 μL         6 μL     3 μL                   3 μL
rs121913530位点GG阳性对照(1×10E4拷贝/μL)                              3 μL      3 μL      不加
rs121913530位点TT阳性对照(1×10E4拷贝/μL)                                              3 μL    3 μL
5.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
过程                  温度    时间
预变性               95℃    90 sec
PCR反应
（45个循环）    95℃    15 sec
                          60℃    60 sec（采集FAM和HEX通道的荧光信号，淬灭基团均为TAMRA）

五、数据处理
6.一般的荧光定量PCR仪在基因分型的模式下，都可以自动根据两个通道获得的荧光值，计算每个样品的比值（HEX值/FAM值），并描出散点图。突变基因型的比值点将位于散点图的X轴方向，正常基因型的比值将位于Y轴方向，杂合子基因型的比值将位于中间，阴性对照的比值将位于原点附近。如果阴性对照有任何信号，则表示污染，本次实验无效，需要寻找原因。散点图的示例如下：

也可以手动整理下表进行基因型判断。首先设置阈值，FAM的阈值根据GG阳性对照的FAM荧光值设置，HEX的阈值根据TT阳性对照的HEX荧光值设置。如果阴性对照有任何信号，则表示污染，本次实验无效，需要寻找原因。如果实验有效，则分析样品。如果样品Ct值低于35，则算有扩增。高于35，则算无扩增。
阳性对照        FAM通道        HEX通道    基因型
GG阳性对照    无扩增           有扩增     纯合突变
GT阳性对照     有扩增           有扩增     杂合突变
TT阳性对照      有扩增           无扩增     正常
阴性对照          无扩增           无扩增           -

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