CAT#:JW-15-14871
低温运输，-20℃保存

副溶血弧菌tdh/tlh/trh三重探针法荧光定量PCR试剂盒

产品及特点
副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)属于弧菌科弧菌属，为革兰氏阴性菌，是一种嗜盐性细菌，广泛存在于海水、海底沉积物、海产动物（如鱼、虾、蟹、贝、海蜇等的体表或者肠道内）和盐分含量较高的腌制食品中（如咸菜、腌鱼等）。通过食用这些海鲜动物，副溶血弧菌可以进入食用者的体内，可引发急性肠胃炎、伤口感染和败血症，甚至导致感染者死亡。副溶血弧菌的主要致病因子是耐热直接溶血素(Thermostable Direct Hemolysin，TDH)、不耐热溶血素(Thermolabile Hemolisin，TLH)和耐热直接溶血素相关溶血素(Thermostable Direct Hemolysin-related Hemolysin，TRH)，分别由tdh、tlh和trh基因编码，因此，同时tdh、tlh和trh基因具有重要意义。本产品就是以探针法qPCR技术为基础开发的相关试剂盒。它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/反应。
3.提供阳性对照，便于排除假阴性结果。
4.特异性高，引物和探针分别根据副溶血弧菌tdh、tlh和trh基因高度保守区设计，不会跟其他生物的DNA或副溶血弧菌的其他基因发生交叉反应。
5.本产品只用于定性检测，不推荐用于定量检测。
6.tdh、tlh和trh基因分别用FAM、HEX和ROX标记的三个探针检测。
7.本产品足够50次20μL体系的探针法qPCR反应。
8.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品使用十孔盒包装
成分                                                编号              规格         包装
2×Probe qPCR MasterMix               981201        500 μL    0.5mL红盖管
荧光PCR专用模板稀释液               180701          1 mL      1.5mL绿盖管
副溶血弧菌tdh、tlh和trh
基因三重PCR引物-探针干粉    yp15-14871         50次      0.5mL棕色管
副溶血弧菌tdh基因阳性对照
（1×10E4拷贝/μL）           pc15-14871tdh         50 μL      0.5mL本色管
副溶血弧菌tlh基因阳性对照    
（1×10E4拷贝/μL）            pc15-14871tlh         50 μL      0.5mL白色管
副溶血弧菌trh基因阳性对照
（1×10E4拷贝/μL）            pc15-14871trh         50 μL      0.5mL黄盖管
使用手册                                   15-14871sc         1份         无
注意：在使用前需要短暂离心引物-探针干粉管，然后在离心管中加入165 μL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂
样品DNA。

使用方法
一、样品DNA的制备
1.如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是样本制备PC（阳性对照），一个是样本制备NC（阴性对照）。可以用自备的、确定三个基因为阳性的样本作为样品制备PC。可以用自备的、确定是阴性的样本作为样品制备NC，可以用水替代。
2.用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容。

二、Probe PCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
3.如果有N+2个核酸提取，则设置N+6个PCR反应，多出的4个1个用于PCR NC，另外三个分别用于
三个待检测基因的PCR PC。在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复）：
成分                                样品管N+2个     PCR NC      tdhPC    tlhPC     trhPC
2×Probe qPCR MasterMix    各10 μL        10 μL         10 μL      10 μL    10 μL
副溶血弧菌
tdh、tlh和trh基因
三重PCR引物-探针溶液    各3 μL             3 μL              3 μL         3 μL      3 μL
N+2个待测DNA                各7 μL             不加              不加         不加     不加
超纯水                                不加                7 μL              不加         不加     不加
副溶血弧菌tdh基因阳性
对照（1×10E4拷贝/μL）    不加                不加              7 μL         不加    不加
副溶血弧菌tlh基因阳性
对照（1×10E4拷贝/μL）    不加                不加              不加         7 μL     不加
副溶血弧菌trh基因阳性
对照（1×10E4拷贝/μL）    不加                不加              不加         不加     7 μL
4.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
过程                  温度    时间
预变性               95℃    10 min
PCR反应
（45个循环）    94℃    30 sec
                          60℃    60 sec（采集FAM通道、HEX通道和ROX通道的荧光信号，淬灭基团均为TAMRA）

三、数据分析
5.原始数据分析。如果FAM通道、HEX通道和ROX通道的Ct大于或等于40，或者没有Ct值，则判为该通道阴性。如果Ct小于40，并且荧光信号呈现倒S的典型扩增曲线，则判断为该通道阳性。
6.实验有效性分析：
6.1、PC：所有PC反应应该在对应的通道呈现阳性，如tdh PC应该为FAM通道阳性，tlh PC应该为HEX通道阳性。如果样本制备PC在其对应的通道为阴性，则整个样本制备实验无效。如果三个基因的PCR PC在其对应的通道为阴性（如tlh PC为HEX通道阴性），则整个PCR扩增实验无效。样本制备无效和扩增实验无效时均不需要分析数据，需要找到原因后再进行后续实验，可能原因包括操作失误、试剂变质或仪器故障。
6.2、NC：样本制备NC和PCR NC应该在所有通道呈阴性。如果样本制备NC或PCR NC结果在任何通道为阳性，则整个样本制备和PCR扩增实验无效，不需要分析数据，需要找到原因后再进行后续实验。可能原因是环境污染。
6.3、如果PC和NC均正常，则实验有效，可以对待测样本结果进行分析。
7.样本结果分析：如果FAM通道、HEX通道和ROX通道的Ct大于或等于40，或者没有Ct值，则判为阴性。如果Ct小于40，并且荧光信号呈现倒S的典型扩增曲线，则判断为该通道对应的基因阳性。FAM通道阳性则表示含有tdh基因，HEX通道阳性则表示含有tlh基因，ROX通道阳性则表示含有trh基因。

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