CAT#:JW-15-rs121434568
低温运输，-20℃保存

人EGFR基因c.2573T>G(L858R)点突变探针法qPCR检测试剂盒

产品及特点
EGFR的全名叫表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)， 是一种广泛分布于人体各组织细胞膜上的具有酪氨酸激酶的糖蛋白，在许多实体肿瘤中EGFR高表达或异常表达，因此,以EGFR为治疗靶标的分子靶向治疗成为国内外肿瘤界关注的焦点。由于EGFR基因激活突变使得靶向治疗效果明显，因此用药前对患者进行EGFR基因激活突变检测具有重要的指导意义。人EGFR基因激活突变最常见的为19号外显子缺失突变和21号外显子的2573T>G突变（rs121434568），它们占人EGFR所有激活突变的80-90%，因此研究2573T>G突变具有重要的研究意义，为此本公司开发了专门检测2573T>G突变的探针法qPCR检测试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到1000拷贝/μL。
3.分辨率高，能检测出5%的点突变。
4.一管式检测，野生型探针用FAM标记，突变型探针用HEX标记。
5.同时提供野生型和突变型两种阳性对照，便于排除假阴性样品。
6.特异性高，引物和探针是根据人EGFR基因2573T>G突变设计，不会跟其他突变发生交叉反应。
7.本产品只能定性，不能定量。
8.本产品足够50次20 μL体系的点突变探针法荧光定量PCR反应。
9.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品采用5孔盒包装
成分                                                          编号                规格            包装
2×点突变Probe qPCR MasterMix         190303             0.5 mL    0.5 mL本色盖
超纯水                                                    210806            1 mL       1.5 mL蓝盖管
人EGFR基因 rs121434568位点检测
引物-探针混合液干粉                ywpb15- rs121434568    50次        0.5 mL白盖管
人EGFP基因 21号外显子野生型
阳性对照(1×10E4拷贝/μL)             pc001egfr-ex21            250 μL    1.5 mL棕色管
人EGFR基因rs121434568位点突变型
阳性对照(1×10E4拷贝/μL)            pc15- rs121434568       250 μL    0.5 mL黄盖管
使用手册                                          15-rs121434568sc       1份            无
注意：使用前需要在引物探针干粉管中加入160 μL的自备超纯水，震荡混匀后再取用一次没用完剩下的需要放-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂
样品DNA。

使用方法
一、样品DNA的制备
1.如果有N个样品，则进行N次纯化，得到的DNA最后溶解在TE中，并需要用NanoDrop进行定量。最后的浓度不能低于0.2ug/μL。
2.本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。

三、点突变Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
3.如果只做1次重复，则标记N+3个PCR管，其中N个用于上步得到的N样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板，NC），3个用于阳性对照（PC）。
4.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加）：
成分                                                        样品管N个    扩增NC    野生型PC    杂合型PC    突变型PC
2×点突变Probe qPCR MasterMix               各10 μL        10 μL        10 μL        10 μL        10 μL
rs121434568位点检测引物-探针混合液       各4 μL          4 μL         4 μL            4 μL           4 μL
 N个DNA样本                                               各3 μL                
超纯水                                                           各3 μL           6 μL        3 μL                             3 μL
人EGFP基因 21号外显子
野生型阳性对照(1×10E4拷贝/μL)                                                       3 μL         3 μL    
人EGFR基因rs121434568位点突变型
阳性对照(1×10E4拷贝/μL)                                                                                   3 μL           3 μL
5.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
过程                    温度    时间
预变性                95℃    90 sec
PCR反应
（45个循环）    95℃    15 sec
                           60℃    60 sec（采集FAM和HEX通道的荧光信号，淬灭基团均为TAMRA）

五、数据处理
6.实验有效性的判断：首先分析扩增NC是否有FAM或/和HEX信号，如果有则表示实验污染，本次实验无效，无需分析所有实验数据，需要寻找原因。如果无则表示实验没有污染，再分析三个PC。如果野生型PC没有FAM扩增信号（有标准的倒S扩增曲线，下同），或突变型PC没有HEX扩增信号，或杂合型PC没有FAM和HEX扩增信号，则表示实验无效，不需要分析样本的数据，需要分析原因。如果三个PC正常（野生型PC有FAM扩增信号，突变型PC有HEX扩增信号，杂合型PC有FAM和HEX扩增信号），则实验有效，可以分析样本的数据。
7.如果荧光定量PCR仪有基因分型的自动分析模块，则进入该模块，获得每个样本的HEX值/FAM值的荧光比值，并根据荧光比值描出散点图。荧光比值位于散点图的X轴方向的样本可以判为突变型，荧光比值将位于Y轴方向的样本可以判为野生型，荧光比值位于X轴和Y轴中间的可以判为杂合子。扩增NC的荧光比值将位于原点附近。散点图的示例如下：

8.如果荧光定量PCR仪没有基因分型的自动分析模块，则需要手动分析。首先根据Ct值判断每个样本在FAM和HEX两个通道的扩增情况。如果FAM通道的Ct低于35，则算FAM信号有扩增。如果Ct大于35或没有Ct，则算FAM通道无扩增。HEX通道也如此操作。然后根据扩增结果按下表判断每个样本的基因型，得到无效数据的样本需要重复：
FAM通道    HEX通道    基因型判断
有扩增        无扩增        野生型
有扩增        有扩增        杂合子
无扩增        有扩增        突变型
无扩增        无扩增        阴性PC或无效数据

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