CAT#:JW-16-55700
低温运输，-20℃保存

传染性胰脏坏死病病毒荧光及可视化RT-LAMP试剂盒

产品及特点
传染性胰脏坏死病病毒（Infectious Pancreatic Necrosis Virus,IPNV）为双RNA病毒属（Birnavirus），为目前已知鱼类病毒中最小的RNA病毒。常见症状为鱼类游动失调，常作垂直回转游动，不久便沉入水底，伺歇片刻后又重复以上游动，直至死亡。主要的特征是胰腺坏死，胰腺泡、胰岛及所有的细胞几乎都发生异常，多数细胞坏死，特别是核固缩、核碎裂十分显著，有些细胞的胞浆内有包涵体。疾病后期，肾脏的造血组织和肾小管也发生变性、坏死，肝脏局灶性坏死，消化道的粘膜发生变性、坏死、剥离。因此快速灵敏诊断IPNV具有重要意义。为此本公司根据独有的双染料RT-LMAP技术，开发了简单快捷的传染性胰脏坏死病病毒RT-LAMP检测试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供RNA样品。
2.恒温扩增，可以不需要荧光PCR等贵重仪器。
3.含可见光和荧光染料，既可以用金属浴和水浴扩增用可见光肉眼判断结果，也可用荧光PCR仪进行实时荧光检测。
4.检测灵敏性一般比RT-PCR高10倍以上，分析灵敏度可以达到100拷贝/反应左右。
5.特异性高，引物是根据传染性胰脏坏死病病毒保守序列设计，不会跟其他生物的RNA发生交叉反应。
6.一般30分钟内出结果，比RT-PCR快。
7.上样量大，对20 mL的反应体系，最大样品加样量高达到14 mL。
8.内含的dUTP-UNG可防交叉污染。
9.提供无传染性的阳性对照，便于分析实验结果。
10.本产品只能用于定性分析，不推荐用于定量分析。
11.本产品足够50次20 mL体系的荧光及可视化RT-LAMP扩增。
12.只可用于科研。

规格及成分
本产品采用5孔盒包装
成分                                                                                                     编号              规格            包装
RT-LAMP MasterMix（可视化染料-荧光染料双染料法，待加酶）    211224a       200 mL     0.5 mL本色盖
逆转录酶-扩增酶混合液                                                                     211208b       100 mL     0.5 mL红盖管
20×传染性胰脏坏死病病毒RT-LAMP引物混合液干粉                   pc16-55700       50次         0.5 mL白盖管
传染性胰脏坏死病病毒RT-LAMP阳性对照（1×10E4拷贝/mL）    yw16-55700      250 mL    0.5 mL黄盖管
超纯水                                                                                                  210806        1 mL       1.5 mL蓝盖管
使用手册                                                                                            16-55700sc    1份           无
注意：引物干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入55 mL的超纯水充分混匀和再使用，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。

自备试剂
样品RNA。

使用方法
一、样品RNA的制备
1.用自选方法纯化样品RNA，本试剂盒跟市场上大多数RNA提取试剂盒兼容，包括本公司的免提取的核酸释放剂。
2.如果有N个样品，则需要做N+2个样品制备，包括一个样品制备阳性对照（PC）和一个样品制备阴性对照（NC）。PC用10 mL本试剂盒提供的阳性对照（1×10E4拷贝/mL）加一定量的水作为样品制备PC，加水后的总体积跟所用核酸纯化试剂盒所要求的起始样本体积一致。NC用水替代。
二、RT-LAMP反应（20mL体系）
3.注意：第一次使用一个新的试剂盒时，必须先将100 mL逆转录酶-扩增酶混合液全部加入到RT-LAMP MasterMix（可视化染料-荧光染料双染料法，待加酶）中，盖上盖子后轻柔颠倒1分钟混匀，然后再取用。
4.反应设置：如果有N+2个RNA纯化样品，则最好设置N+4个RT-LAMP扩增，增加RT-LAMP扩增阳性对照和RT-LAMP扩增阴性对照各1个。在N+4个PCR管中加入下列成分：
成分                                                                                N+2个样品管    RT-LAMP阴性对照    RT-LAMP阳性对照
RT-LAMP MasterMix（可视化染料-荧光染料，已加酶）     各5 mL               5 mL                          5 mL
20×传染性胰脏坏死病病毒RT-LAMP引物混合液                  各1 mL               1 mL                          1 mL
N+2个样品RNA                                                                     各14 mL                -                               -
超纯水                                                                                        -                   14 mL                           -
传染性胰脏坏死病病毒RT-LAMP阳性对照（1×10E4拷贝/μL） -                       -                                14 mL
5.本产品含两种染料，故最好使用荧光PCR仪器进行扩增。设置60次循环，每次65℃保温1分钟，采集SYBR通道的荧光信号。

三、结果分析
6.电泳分析：由于取样时非常容易产生气溶胶污染，污染实验环境并且非常难清除污染，所以强烈建议不要采取此方法分析实验结果。即使使用，也要在不同的房间，使用不同的移液枪操作。具体做法是取10 mL RT-LAMP扩增产物跟自备上样液混合后进行2%琼脂糖凝胶电泳。RT-LAMP阳性对照必须有正常RT-LAMP条带（200bp左右的梯形扩增产物），RT-LAMP阴性结果必须无条带，否则实验结果无效。如果RT-LAMP阳性对照和阴性对照结果正常，再分析待测样品。典型的电泳结果见下表，奇数样为阴性结果，偶数样为阳性结果：

7.可将光（肉眼）分析：样品制备阳性对照和RT-LAMP阳性对照的反应液将呈蓝色，样品制备阴性对照和RT-LAMP阴性对照的反应液将呈淡蓝色或无色，否则提取实验或扩增实验无效。如果阳性和阴性对照结果正常，则实验有效，可以分析样品的情况。样品管的颜色接近扩增阳性对照管则说明样品为阳性，如果接近阴性对照则说明待测样品为阴性。典型的可将光检测结果见下图（9为阴性，10为阳性）。

8.荧光分析（仅限于用qPCR仪进行反应的场景）：样品制备阳性对照和RT-LAMP阳性对照的反应液将有标准的S扩增曲线，样品制备阴性对照和RT-LAMP阴性对照的反应液将没呈平线，没有S曲线，否则提取实验或扩增实验无效。如果阳性和阴性对照结果正常，则实验有效，可以分析样品的情况。样品管的荧光曲线为S型，则说明样品为阳性，如果为平线则说明待测样品为阴性。典型的荧光检测结果见下图。左边为阳性，右边为阴性。
        
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