CAT#:JW-16-44500
低温运输，-20℃保存

毛癣菌通用可视化染料-荧光染料LAMP试剂盒

产品及特点
毛癣菌（Trichophyton spp.）是子囊菌门真菌，可引起人皮肤病变。毛癣菌造成皮肤感染为最常见，可感染皮肤、毛囊与指甲等组织，其症状与小孢癣菌和表皮癣菌相似。毛癣菌会造成头癣、胡癣、体癣、股癣、甲癣、灰指甲、富贵手及足癣等。毛癣菌的给人类健康造成严重影响，因此毛癣菌的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。为此本公司开发了简单快捷的毛癣菌双染料LAMP检测试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供DNA样品。
2.恒温扩增，可以不需要荧光PCR等贵重仪器。
3.含可见光和荧光染料，既可以用金属浴和水浴扩增用可见光肉眼判断结果，也可用荧光PCR仪进行实时荧光检测。
4.检测灵敏性一般比PCR高10倍以上。
5.特异性高，根据毛癣菌保守序列设计4条特异引物，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。
6.一般30分钟内出结果，比PCR快。
7.上样量大，对20μL的反应体系，最大样品加样量高达到14 μL。
8.内含的dUTP-UNG可防交叉污染。
9.提供无传染性的阳性对照，便于分析实验结果。
10.本产品只能用于定性分析，不推荐用于定量分析。
11.本产品足够50次20μL体系的荧光及可视化LAMP扩增。
12.只可用于科研。

规格及成分
本产品采购5孔盒包装
成份                                                                                                   编号            规格        包装
4×LAMP MasterMix （可视化染料-荧光染料双染料法，待加酶）211223a        200 μL    0.5mL绿盖管
Bst DNA聚合酶2.0                                                                        11-220319     50 μL      0.5mL红盖管
20×毛癣菌LAMP引物干粉                                                           yw16-44500     50 次      0.5mL白盖管
毛癣菌LAMP阳性对照（1×10E4拷贝/μL）                                   pc16-44500    250 μL    0.5mL黄盖管
超纯水                                                                                           210806            1 mL      1.5mL蓝盖管
使用手册                                                                                       16-44500sc      1 份            无
注意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入200μL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。

自备物品
待测样品。

使用方法
一、样品DNA的制备
1.用自选方法纯化样品DNA，本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容，包括本公司的免提取的核酸释放剂。
2.如果有N个样品，则需要做N+2个样品制备，包括一个样品制备阳性对照（PC）和一个样品制备阴性对照（NC）。PC用10μL本试剂盒提供的阳性对照（1×10E4拷贝/μL）加一定量的水作为样品制备PC，加水后的总体积跟所用核酸纯化试剂盒所要求的起始样本体积一致。NC用水替代。

二、LAMP反应（20μL体系）
3.反应设置：第一次使用时请把所有Bst DNA聚合酶2.0（50μL，本试剂盒提供）加入到4×LAMP MasterMix（可视化染料-荧光染料双染料法，待加酶）中，轻柔颠倒20次充分混匀，然后再取用。如果有N+2个DNA纯化样品，则最好设置N+4个LAMP扩增，增加LAMP扩增阳性对照和LAMP扩增阴性对照各1个。在N+4个PCR管中加入下列成分：
成分                                                            N+2个样品管    LAMP阴性对照    LAMP阳性对照
4×荧光/可见光LAMP MagicMix（加酶后）    各5 μL                5 μL                   5 μL
20×毛癣菌LAMP引物混合液                           各1 μL               1 μL                   1 μL
N+2个样品DNA                                               各14 μL             -                          -
超纯水                                                               -                     14 μL                     -
第2步所得阳性对照的10倍稀释液                     -                       -                        14 μL
4.如果使用金属浴或水浴保温，没有热盖，则每个反应管中加入50μL自备的PCR级石蜡油，否则保温期间反应体系的水分会蒸发到管盖下方凝集，反应体积变化，会严重影响反应效率，增加假阳性率。最后置于65℃保温60分钟进行扩增。
5.如果使用常规PCR仪进行LAMP反应，设置程序时必须打开热盖，设置成65℃保温60分钟进行扩增。
6.如果使用荧光定量PCR仪，则设置60次循环，每次65℃保温1分钟，采集SYBR通道的荧光信号。

三、结果分析
7.电泳分析：由于取样时非常容易产生气溶胶污染，污染实验环境并且非常难清除污染，所以强烈建议不要采取此方法分析实验结果。即使使用，也要在不同的房间，使用不同的移液枪操作。具体做法是取10μL LAMP扩增产物跟自备上样液混合后进行2%琼脂糖凝胶电泳。LAMP阳性对照必须有正常LAMP条带（200bp左右的梯形扩增产物），LAMP阴性结果必须无条带，否则实验结果无效。如果LAMP阳性对照和阴性对照结果正常，再分析待测样品。典型的电泳结果见下表，奇数样为阴性结果，偶数样为阳性结果：

8.可将光（肉眼）分析：样品制备阳性对照和LAMP阳性对照的反应液将呈蓝色，样品制备阳性对照和LAMP阳性对照的反应液将呈淡蓝色或无色，否则提取实验或扩增实验无效。如果阳性和阴性对照结果正常，则实验有效，可以分析样品的情况。样品管的颜色接近扩增阳性对照管则说明样品为阳性，如果接近阴性对照则说明待测样品为阴性。典型的可将光检测结果见左图（9为阴性，10为阳性）。

9.荧光分析（仅限于用qPCR仪进行反应的场景）：样品制备阳性对照和LAMP阳性对照的反应液将有标准的S扩增曲线，样品制备阴性对照和LAMP阴性对照的反应液将没呈平线，没有S曲线，否则提取实验或扩增实验无效。如果阳性和阴性对照结果正常，则实验有效，可以分析样品的情况。样品管的荧光曲线为S型，则说明样品为阳性，如果为平线则说明待测样品为阴性。典型的荧光检测结果见下图。左边为阳性，右边为阴性。
    
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