CAT#:JW-17-18610
低温运输，-20℃保存

杜氏利什曼原虫探针法qPCR试剂盒（含内参）

产品及特点
杜氏利什曼原虫（Leishmania donovani ）是一种专性细胞内原虫，是致内脏利什曼病（黑热病）的病原体，主要寄生在患者的血液、肝、脾、骨髓和淋巴结中，使机体单核—巨噬细胞过度增生，临床主要表现为脾肿大、发热、贫血及营养不良等。目前，黑热病仍在我国四川、甘肃、陕西、内蒙古、新疆等地流行，危害严重。因此，快速检测杜氏利什曼原虫感染具有重要意义。本产品就是以探针法qPCR技术为基础开发的专门检测杜氏利什曼原虫感染的试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板
2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/反应。
3.提供阳性对照，用于制备标准曲线和用作扩增对照，排除假阴性实验。
4.含识别内源性内参的引物和探针，便于排除PCR假阴性样本。
5.特异性高，靶分子的引物和探针是根据杜氏利什曼原虫DNA高度保守区设计，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。
6.既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
7.本产品足够50次20μL体系的探针法PCR反应。
8.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品使用五孔盒包装
成分                                                                                        编号                规格           包装
2×Probe qPCR MasterMix                                                    981201            500 μL    0.5 mL本色盖
荧光PCR专用模板稀释液                                                      180701            1 mL      1.5 mL绿盖管
杜氏利什曼原虫PCR引物-探针干粉（含内参引物探针）    yp17-18610        50次      0.5 mL棕色管
杜氏利什曼原虫PCR阳性对照(1E7拷贝/μL)                           Pc18610          50 μL    0.5 mL黄盖管
使用手册                                                                              17-18610sc         1份            无
注意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入216mL超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备物品
样品DNA。

使用方法
一、稀释标准曲线样品（以阳性对照1E1-1E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。
1.标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
2.在各管中加入45μL荧光PCR专用模板稀释液。
3.在6号管中加入5 μL 1×1E7拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在5号管中加入5 μL 1E6拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在4号管中加入5 μL 1E5拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线阳性样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备
7.如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是制备PC（样品制备阳性对照），一个是制备NC（样品制备阴性对照）。可以用确认是阳性的样本作为阳性对照，用确认是阴性的样本作为阴性对照。
8.用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
9.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复）：
成分                                                                           样品管N+2个    PCR阴性对照    标准曲线样品管（1-6管）
2×Probe qPCR MasterMix                                             各10 μL            10 μL                    各10 μL
杜氏利什曼原虫PCR引物-探针混合液(含内参引物探针) 各4 μL              4 μL                     4 μL
N+2个待测样（含内源性内参）                                      各6 μL              不加                    不加
超纯水                                                                             不加                  6 μL                     不加
第6步所得标准曲线样品稀释液（含内参，1-6号）        不加                不加    各6 μL（2号样到2号管，3号样到3号管…）
11.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
过程                        温度      时间
预变性                     95℃    4 min
PCR反应
（40个循环）          95℃    15 sec
                                60℃    45 sec（采集FAM通道和Cy5通道的荧光信号，淬灭基团均为BHQ）

四、数据处理
12.阴性阳性判断：没有Ct读数，或Ct大于40判为阴性结果。有Ct读数，Ct值小于40，荧光信号有对数增长，有典型扩增曲线判为阳性结果。每个样本需要对FAM通道和Cy5通道的结果分别进行判定，得到两个结果。
13.实验有效性判断：如果扩增阳性对照或制备阳性对照FAM通道结果为阴性则整个实验无效，不需要分析数据，需要分析原因，可能是操作、仪器和试剂三方面的原因，重做扩增或制备或跟仪器和试剂厂家联系。如果扩增阴性对照或制备阴性对照FAM通道结果为阳性，说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析数据，需要分析失败原因，直到污染消除。如果阳性对照和阴性对照正常，则进入下一步分析样本的有效性。
14.样本有效性判断：如果样本FAM通道的结果为阳性，则无论内参Cy5通道的结果是阴性还是阳性，样本的结果均有效。如果样本结果为阴性，内参通道结果也为阴性，则此样品的阴性结果无效。此样品需要重新提取核酸和进行扩增。
15.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，分别以阳性对照FAM通道和内参Cy5通道的Ct值为纵轴，绘制标准曲线，阳性对照FAM通道读数的标准曲线为斜线，r2必须大于0.95，内参Cy5通道读数的标准曲线为一条跟X轴平行的横线。再以待测样品的Ct值从阳性对照FAM通道读数的标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
16.如果用于定性实验，对待测样品，如果其FAM通道的Ct没有读数、或Ct大于或等于40则均为阴性，如果小于40则为阳性。对任何FAM通道结果为阴性的待测样本，如果其对应的内参Cy5通道也为阴性，则此样品的阴性结果无效，此样品需要重复实验。

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