CAT#:JW-17-001-Y
低温运输，-20℃保存

人Y染色体探针法qPCR试剂盒（含内参）

产品及特点
人Y染色体上95%是男性特异区域，里面含和男性有关的基因。本产品就是以其中一个基因为靶分子，设计的探针法荧光定量PCR产品，专门用于检测样品中是否有人Y染色体存在，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到10拷贝/反应。
3.提供阳性对照，便于排除假阴性实验。
4.能检测内源性内参基因（位于X染色体），便于排除假阴性样品。
5.特异性高，引物是根据人Y染色体高度保守区设计，不会跟人的其他染色体的DNA发生交叉反应。
6.既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量时其线性范围不少于5个数量级。
7.本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
8.本产品只能用于科研。

规格及成分
成分                                                                         编号             规格     包装
2×Probe qPCR MasterMix                                    981201         0.5 mL    0.5 mL本色管
荧光PCR专用模板稀释液                                     180701          1 mL        1.5 mL绿盖管
人Y染色体专一性引物-探针混合液（含内参）     yp17-001-Y    150 μL    0.5 mL棕色管
人男性基因组DNA阳性对照(1×1E3拷贝/μL)        220146           50 μL      0.5 mL黄盖管
人女性基因组DNA溶液(1×1E3拷贝/μL)                220123           50 μL     0.5 mL蓝盖管
使用手册                                                            sc17-001-Y        1份            无
本产品采用5孔盒包装

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂
样品DNA。

使用方法
一、稀释标准曲线样品（以10E0-10E4拷贝/μL这5个10倍稀释度为例）。
1.标记4个离心管，分别为3，2，1，0。
2.分别加入45μL 荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头（下同）。
3.在3号管中加入5μL 1×10E4拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E3拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在2号管中加入5μL 1×10E3拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E2拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在1号管中加入5μL 1×10E2拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E1拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.换枪头，在0号管中加入5μL 1×10E1拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E0拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
7.上面的操作得到0-3号标准曲线样品，将试剂盒提供的人男性基因组DNA阳性对照(1×10E4拷贝/μL)当成4号样品，共5个样品，放冰上待用。

二、样品DNA的制备
8.如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照，选用确定含Y染色体的样本），一个是NC（样品制备阴性对照，选用确定不含Y染色体的样本）。
9.用自选方法纯化样品DNA，本产品跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容。

三、Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
10.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+8个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（本试剂盒提供的人女性DNA溶液），5个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（本试剂盒提供的人女性DNA溶液），1个用于PCR阳性对照（本试剂盒提供的人男性DNA阳性对照）。下面只以定量分析为例。
11.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复）：
成分                                                                        样品管N+2个    PCR阴性对照    标准曲线样品管（0-4号管）
2×Probe qPCR MasterMix                                        各10μL                   10μL                   各10μL
人Y染色体专一qPCR引物-探针混合液（含内参）    各3μL                      3μL                    各3μL
 N+2个待测DNA样本                                                各7μL                       不加                   不加
超纯水                                                                       不加                       7μL                       不加
第7步所得标准曲线样品稀释液（0-4号）                  不加                   不加            各7 μL（1号样到1管，2号样到2管…）
12.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
过程                   温度     时间
预变性                95℃    5 min
PCR反应
（50个循环）    95℃    15 sec
                          54℃    15 sec
                          72℃    15 sec（采集FAM和Cy5通道的荧光信号，MGB为淬灭基团）
四、数据处理
13.阴性阳性判断：没有Ct读数，或Ct大于45的PCR反应结果判为阴性。有Ct读数，Ct值小于45，荧光信号有对数增长，有典型倒S型扩增曲线的PCR反应结果判为阳性。每个PCR反应管需要同时对FAM通道和Cy5通道的结果分别进行判定，得到对应靶分子和内参的两个结果。
14.PCR实验有效性判断：如果样本制备阳性对照管或扩增阳性对照管FAM通道结果为阴性，则整个实验无效，不需要分析数据，需要分析原因，可能是操作、仪器和试剂三方面的原因，重做扩增或制备或跟仪器和试剂厂家联系。如果样本制备阴性对照管或扩增阴性对照管FAM通道结果为阳性，说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析数据，需要分析失败原因，直到污染消除。如果上述阳性对照管和阴性对照管结果正常，则进入下一步。
15.样本有效性判断：如果样本管FAM通道的结果为阳性，Cy5通道结果是阴性，则样本的阳性结果有效。如果样本管FAM通道和Cy5通道的结果均为阳性，并且FAM通道的Ct值小于Cy5通道的Ct值，则样本的阳性结果有效。如果FAM通道的Ct值大于Cy5通道的Ct值，则样本的阳性结果无效。如果样本管FAM通道和Cy5通道的结果均为阴性，则此样品管的阴性结果无效。可能原因是样本丢失或有抑制剂，需要用其所对应的样品重新提取核酸和进行PCR扩增。
16.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，分别以阳性对照FAM通道和内参Cy5通道的Ct值为纵轴，绘制标准曲线，阳性对照FAM通道读数的标准曲线为斜线，r2必须大于0.95。内参Cy5通道读数的标准曲线将跟FAM的标准曲线平行。再以待测样品的Ct值从阳性对照FAM通道读数的标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再换算成浓度X拷贝/反应。
17.如果用于定性实验，对待测样品，如果其FAM通道的Ct没有读数、或Ct大于或等于45则均为阴性，如果小于45则为阳性。对任何FAM通道结果为阴性的待测样本，如果其对应的内参Cy5通道也为阴性，则此样品的阴性结果无效，此样品需要重复实验。

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