CAT#:JW-17-15927-15905
低温运输，-20℃保存
甲型流感病毒H16N5亚型双重探针法qRT-PCR检测及分型试剂盒（含内参）
产品及特点
甲型流感病毒(Influenza A Virus)是常见流感病毒(简称禽流感)，甲型流感病毒某些亚型，如H16N5亚型，可以引起急性呼吸道传染病，即甲型流感，其症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高。此病可通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播，严重威胁人类健康，因此快速检测甲型流感H16N5亚型具有重要的意义。本产品就是以探针法qPCR技术为基础开发的专门检测甲型流感H16N5亚型的试剂盒,它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。
2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/反应。
3.提供阳性对照和内参，便于排除假阴性结果。
4.特异性高，引物是根据甲型流感H16N5病毒RNA高度保守区设计，不会跟其他生物的RNA发生交叉反应。
5.既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5各数量级。
6.本产品足够50次20μL体系的探针法qRT-PCR反应。
7.本产品只能用于科研。
规格及成分
成分 编号 规格 包装
探针法qRT-PCR缓冲液 990504a 500 μL 0.5mL蓝盖管
探针法qRT-PCR酶混合液v2 990504bv2 50 μL 0.5mL红盖管
荧光PCR模板专用稀释液 180701 1 mL 1.5 mL绿盖管
H16N5亚型qRT-PCR引物-探针干粉（含内参探针） yp17-15927-15905 50 次 1.5mL棕色管
H16亚型qRT-PCR阳性对照(1×10E7拷贝/μL) pc15927 50 μL 0.5mL黄盖管
N5亚型qRT-PCR阳性对照(1×10E7拷贝/μL) pc15905 50 μL 0.5mL白盖管
人基因组DNA内参阳性对照(1×10E4拷贝/μL) 220146 50 μL 0.5 mL橙盖管
使用手册 17-15927-15905sc 1份 无
本产品采用十一孔盒包装
注意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入216uL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。
运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为24个月。
自备试剂
样品RNA。
使用方法
一、稀释含内参的H16标准曲线样品，是否做H16标曲由客户决定。
1.标记6个离心管，分别为A6，A5，A4，A3，A2，A1，A0。
2.在A0号管中加入280μL荧光PCR专用模板稀释液，35μL本试剂盒提供的人基因组DNA内参（35000拷贝），震荡一分钟混匀。内参浓度为1111拷贝/μL。
3.用带芯枪头分别将上步得到的混合液按45μL/管加入到标记的A1-A6号管中，最好用带芯枪头（下同）。
4.在A6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的H16阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的H16标准曲线样品，内参浓度为1000拷贝/μL。放冰上待用。
5.换枪头，在A5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的H16标准曲线样品，内参浓度为1000拷贝/μL。放冰上待用。
6.换枪头，在A4号管中加入5 μL 1×10E5拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的H16标准曲线样品，内参浓度为1000拷贝/μL。放冰上待用。
7.重复上面的操作得到A1-A6共六个稀释度的H16标准曲线阳性样品，内参浓度均为1000拷贝/μL。放冰上待用。
二、稀释含内参的N5标准曲线样品，是否做N5标曲由客户决定。
8.操作同上，只是使用N5的PC作为模板。得到6个浓度的样本放冰上待用，内参浓度均为1000拷贝/μL，分别是B1-B6
二、样品RNA的制备
9.用自选方法纯化N个样品的RNA。由于本试剂盒的这个版本只提供DNA作为内参，因此不能监控纯化过程。
三、Probe qRT-PCR反应（本试剂提供的内参为DNA，只能监控PCR过程）
10.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+1+6+6个RT-PCR管，其中N个管用于上步得到的N个样品，1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板），6个用于H16的标准曲线，另外6个用于N5的标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+3个RT-PCR管，其中N个管用于上步得到的N个样品，1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板），1个用于H16 RT-PCR阳性对照，1个用于N5 RT-PCR阳性对照（直接用第一步和第二步所得的两个4号稀释液作为模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
11.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复）：
成分 样品管N个 RT-PCR阴性对照 标曲样品管（A1-A6） 标曲样品管（B1-B6）
探针法qRT-PCR缓冲液 各10 μL 10 μL 各10 μL 各10 μL
探针法qRT-PCR酶混合液v2 各1 μL 1 μL 各1 μL 各1μL
H16N5RT-PCR引物-探针混合液（含内参引物和探针） 各4 μL 4 μL 各4 μL 各4 μL
N个待测RNA 各5 μL 不加 不加 不加
超纯水 不加 5 μL 不加 不加
第一步所得标准曲线
样品稀释液（A1-A6号） 不加 不加 各5μL（A2号样到A2号管，A3号样到A3号管…） 不加
第二步所得标准曲线
样品稀释液（B1-B6号） 不加 不加 不加 各5μL（B 2号样到B 2号管，B 3号样到B 3号管…）
12.盖上盖子后上机，按下面参数进行RT-PCR：
过程 温度 时间
逆转录 50℃ 10 min
预变性 95℃ 10 min
PCR反应
（45个循环） 95℃ 15 sec
60℃ 45 sec（采集FAM通道、HEX通道和Texas Red 三个通道的荧光信号，淬灭基团均为TAMRA）
四、数据处理
13.如果扩增阳性对照结果为阴性，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要重做扩增或制备或跟厂家联系。如果扩增阴性对照为阳性，说明环境污染，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系，购买新的引物和探针。
14.如果阴性对照和阳性对照正常，则实验有效，可以进入后续分析。
15.对定量检测，以标曲样本浓度的log值为横轴，分别以H16阳性对照（FAM通道）和N5阳性对照（HEX通道）的Ct值为纵轴，绘制两条标准曲线，R2必须大于0.95。再以待测样品的Ct值从分别从两条标准曲线上推算出对应样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。
16.对定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照FAM通道的Ct必须大于或等于40。阳性对照FAM通道的荧光信号必须有对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于35。对待测样品，如果其FAM通道的Ct大于或等于40则为H16阴性，如果小于或等于35则为H16阳性。如果其HEX通道的Ct大于或等于40则为N5阴性，如果小于或等于35则为N5阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。
17.对H16或N5阴性样本，如果内参为阳性（Texas Red荧光通道有信号，信号有对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于35），则判断为真阴性。如果内参为阴性（TET荧光通道没有信号，信号没有对数增长，没有典型扩增曲线，Ct值大于35），则不能判断，本样本需要重复。对H16或N5阳性样本，不需要分析内参的结果。
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