CAT#:JW-JW-17-81800-vanA-vanB
低温运输，-20℃保存

耐万古霉素肠球菌vanA/vanB探针法qPCR试剂盒（含内参）说明书

产品及特点：
耐万古霉素肠球菌（Vancomycin-Resistant Enterococcus，VRE）又名万古霉素抗药性肠球菌，是肠球菌属下的一种细菌，有着对万古霉素这种抗生素的抗药性。在肠球菌属中，对人类有着病原性的有粪肠球菌（Enterococcus faecalis）及屎肠球菌（Enterococcus faecium）。而所有屎肠球菌更是有着抗药性的，亦即所有屎肠球菌都是VRE。VRE特别对免疫系统受损的人有危险性，可以引起心内膜炎、败血病及尿道感染等病症，严重威胁人类健康，因此快速检测耐万古霉素肠球菌vanA/vanB具有重要的意义。本产品就是以探针法qPCR技术为基础开发的专门检测耐万古霉素肠球菌vanA/vanB的试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板
2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/反应。
3.提供阳性对照，便于制备标准曲线和用作扩增对照，排除假阴性结果。
4.含识别内源性内参的引物和探针，便于排除PCR假阴性样本。
5.特异性高，靶分子的引物和探针是根据耐万古霉素肠球菌vanA/vanBDNA高度保守区设计，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。内参的引物和探针是根据肠球菌DNA高度保守区设计，也不会跟其他生物的DNA发生交叉反应
6.既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5各数量级。由于是三重检测，故不推荐用于定量检测。需要定量的最好使用单重的相关试剂。
7.本产品足够50次20μL体系的探针法PCR反应。
8.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品使用五孔盒包装
成分                                                                编号         规格           包装
2×Probe qPCR MasterMix                        981201         500 μL    0.5 mL本色盖
荧光PCR专用模板稀释液                          180701         1 mL       1.5 mL绿盖管
耐万古霉素肠球菌vanA/vanB PCR 引物-探针干粉
（含内参引物探针）                    17-81800-vanA-vanB    50次     0.5 mL白盖管
耐万古霉素肠球菌vanA
PCR阳性对照(1E4拷贝/μL)             Pc81800-vanA           50 μL    0.5 mL黄盖管
耐万古霉素肠球菌vanB
PCR阳性对照(1E4拷贝/μL)              Pc81800-vanB           50 μL    0.5 mL黄盖管
使用手册                                 sc17-81800-vanA-vanB       1份            无
注意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入220 mL超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备物品
样品DNA。

使用方法
一、样品DNA的制备
1.如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是制备PC（样品制备阳性对照），一个是制备NC（样品制备阴性对照）。可以用确认是阳性的样本作为阳性对照，用确认是阴性的样本或水作为阴性对照。
2.用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、Probe qPCR反应（20 μL体系，在样品制备室进行）
3.如果做只做1次重复实验，则标记N+3个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于VanA基因PCR阳性对照（直接用本试剂盒提供的VanA阳性对照为模板），1个用于VanB基因PCR阳性对照（直接用本试剂盒提供的VanB阳性对照为模板）。
4.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复）：
成分                                                样品管N+2个      PCR阴性对照      VanA PCR阳性对照      VanB PCR阳性对照
2×Probe qPCR MasterMix                   各10 μL              10 μL                          10 μL                            10 μL
耐万古霉素肠球菌vanA/vanB PCR引物-探针
混合液(含内参引物探针)                       各4 μL                 4 μL                            4 μL                             4 μL
N+2个待测样（自带内源性内参）        各6 μL                  不加                           不加                              不加
耐万古霉素肠球菌vanA
PCR阳性对照(1E4拷贝/μL)                   不加                    不加                            6 μL                             不加
耐万古霉素肠球菌vanB
PCR阳性对照(1E4拷贝/μL)                   不加                     不加                           不加                               6 μL
超纯水                                                    不加                    6 μL                           不加                               不加
5.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
过程                                    温度    时间
预变性                                95℃    4 min
PCR反应（40个循环）      95℃    15 sec
                                           60℃    45 sec（采集FAM通道、HEX通道和Cy5通道的荧光信号，淬灭基团均为MGB）

四、数据处理
6.阴性阳性判断：没有Ct读数，或Ct大于40判为阴性结果。有Ct读数，Ct值小于40，荧光信号有对数增长，有典型扩增曲线判为阳性结果。每个反应管均可得到FAM通道、HEX通道和Cy5通道的Ct数值和对应的阴性和阳性结果。
7.实验有效性判断：如果样本制备阳性对照管或/和PCR阳性对照管的FAM通道信号结果为阴性，则整个实验无效，不需要分析数据，需要分析失败原因，可能是操作、仪器和试剂三方面的原因，需要重做扩增或/和核酸制备，也可以直接跟仪器和试剂厂家联系。如果样本制备阴性对照管或/和PCR阴性对照管的FAM通道结果为阳性，说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析数据，需要分析污染原因并将污染清除。如果两个阳性对照和两个阴性对照结果正常，说明本次实验有效，可以进入下一步分析。
8.样本VanA基因检测有效性判断：如果待测样本FAM通道的结果为阳性，则无论该样本的Cy5通道（对应内源内参）的结果是阴性还是阳性，该样本FAM通道的结果有效。如果待测样本管FAM通道的结果为阴性，Cy5通道结果也为阴性，则此样品的阴性结果无效。此样品需要重新提取核酸和进行扩增。
9.样本VanB基因检测有效性判断：如果待测样本HEX通道的结果为阳性，则无论该样本的Cy5通道（对应内源内参）的结果是阴性还是阳性，该样本HEX通道的结果有效。如果待测样本管HEX通道的结果为阴性，Cy5通道结果也为阴性，则此样品的阴性结果无效。此样品需要重新提取核酸和进行扩增。

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