CAT#:JW-7-230703
常温运输和保存

ATPase活性测定试剂盒（比色法）

产品及特点
P-type ATPase是非常重要的一类细胞膜蛋白，又叫离子泵（Ion Pump）或磷脂转运酶（Lipid Flippase），它参与形成Na+、K+、H+等多种重要离子的电位梯度形成和脂肪分子的非对称分布，而这两者是很多非常基础的细胞活动的基础（如神经活动），它们耗费细胞1/3以上的能量，在脑中耗费甚至高达70%，因此是非常重要的研究课题。P-type ATPase的活性检测是研究此酶和此酶相关促进剂和抑制剂的重要手段，其活性可以通过检测磷脂转运、检测离子跨膜运输和检测ATP水解等多种方法达成。本产品就是基于ATP水解的比色检测法开发的试剂盒，它具有以下特点：
1.即开即用，不需要用户单独准备所有溶液。
2.适合于包括P-type ATPase在内的各种ATPase等。
3.样本中不得有其他ATP水解酶的污染。
4.提供标准品，能检测到nmol级别的ATP水解，可以测到浓度为0.005U/L得ATPase。
5.本产品也可以用于无机磷的检测。
6.足够100次1mL比色皿测定，或足够至少200次或更多次微孔板测定。
7.本产品只能用于科研。
8.本试剂盒1个单位ATPase的定义是在25℃ pH7.5的条件下，1分钟能释放1umol磷酸所需的酶量。

规格及成分
第一部分：ATP活性测定试剂盒常温成分，7-230703pt1，小扁盒包装
成分                                编号             规格           包装
ATPase显色液成分1    7-230703b1     25 mL    30 mL本色瓶
ATPase显色液成分2    7-230703b2     75 mL    120 mL本色瓶
ATPase显色液成分3    7-230703b3     4 mL       5 mL本色瓶
ATPase显色终止液      7-230703c        10 mL    10 mL本色管
10mM磷酸标准品         7-230703d       0.5 mL    0.5 mL白盖管
使用手册                      7-230703sc       1份                无
第二部分：ATP活性测定试剂盒低温成分，7-230703pt2，塑料袋包装
成分                                   编号             规格          包装
无底物ATPase反应液    7-230703a        5 mL    5 mL本色瓶
ATPase底物干粉           7-230703b       100次    0.5mL本色管

运输及保存
常温运输和保存，保质期12个月。

自备物品
1.5毫升离心管、分光光度仪。

使用方法
一、制备待测样品（本试剂盒不含相关试剂）
1.按自选方法制备ATPase样本，此蛋白是膜蛋白。
2.测定膜蛋白浓度，此数据将用于计算P-type ATPase的比活。
3.将膜蛋白浓度调到500ug/mL，放冰上待用。
4.制备ATPase样本时需要加上所需要得对照。
5.如果使用细胞裂解液作为样本，需要用无底物ATPase反应液作为匀浆液。得到的裂解液可能有内源磷酸盐的干扰，需要先予以去除。

二、新鲜配制下列溶液待用
6.含底物的ATPase反应液：1次1mL比色皿测试需要0.1mL含底物的ATPase反应液。如果有N个样本，则需要做N+2次反应，其中1个无ATPase对照，一个是有ATPase对照（如果无此对照，可以不做），故共需要（N+2）×0.1mL的含底物的ATPase反应液。如果需要做N次重复，则配制的体积×N。假设需要配制1mL，则将1 mL无底物的ATPase反应液和10uL ATPase底物溶液含底物的ATPase反应液，放冰上待用。注意：首次使用ATPase底物时在ATPase底物干粉管中加入1mL超纯水，涡旋20秒混合即得ATPase底物溶液。该溶液需要分装成小管放-20℃，避免反复冻融。
7.无底物的ATPase反应液：试剂盒提供，所需体积同上步，直接放冰上待用。
8.ATPase反应显色液：1次1mL比色皿测试需要0.8mL ATPase反应显色液。如果有个样本，则需要做N+2个含底物的ATPase反应和N+2个无底物的ATPase反应（见上述两步），还需加1个无显色液对照和5个显色标曲样本，共需要（2N+10）×0.8mL的ATPase反应显色液。假设需要配制10 mL，则将7.5mL的ATPase反应显色液成分1和ATPase反应显色液成分2混合，脱色摇床上摇晃30分钟，用针头过滤器过滤，加入0.4mL ATPase反应显色液成分3摇晃5分钟混匀，得ATPase反应显色液。放冰上待用。
9.标曲样本：将10uL10mM磷酸标准品加入到990uL超纯水中，涡旋震荡30秒得到100uM磷酸溶液，分别将0、10、20、30、40、50uL此溶液加入到标注为0-5的6个1.5mL塑料管中，分别加入200uL、190uL、180uL、170uL、160uL和150uL的无底物ATPase反应液，涡旋震荡30秒后放冰上待用。0-5号管中的磷酸nmol数分别为0、1、2、3、4、5nmol。此将在制作标准曲线时作为横坐标。

三、ATPase反应和显色反应（分别为0.2mL体系和1mL体系）
10.按下表完成ATPase反应（如果每个样品做1次重复，共2N+4个反应）：
                                           A组：有底物                                                B组：无底物
成分                    N个样本管     有酶对照管     无酶对照管     N个样本管     有酶对照管     无酶对照管
N个待测样本
0.1mL                 加                                                                      加        
确认含ATPase的样本0.1mL           加                                                                    加    
水0.1mL                                                              加                                                                    加
含底物的ATPase反应液0.1mL    加            加            加            
无底物的ATPase反应液0.1mL                                                       加                    加                    加
25℃30分钟
11.按下表完成显色反应（如果每个样本做1次重复，共2N+11个反应）。A组和B组的2N+4个样本可以直接在上步的管中进行后续操作：
成分                 A组N+2个样品管     B组N+2个样本管     无显色液对照管     0-5号标曲样本管
来于上步的反应样本    各0.2mL         各0.2mL        
无底物ATPase
反应液                                                                                   0.2mL    
 6个标准曲线样本
第8步制备                                                                                                       按对应编号各 0.2 mL
ATPase反应显色液    各0.8 mL            0.8 mL                 0.8 mL                       各0.8 mL
混匀后溶液立即呈现鲜绿色，1分钟后立即进入下一步
ATPase反应终止液    各0.1 mL           0.1 mL                 0.1 mL                       各0.1 mL
混匀后25℃放置30分钟，660nm测吸光值。以水校零
四、数据分析
12.如果所有样本包括有酶对照管和标曲都没有读数，则整个实验无效。
13.如果无酶对照管、无显色液对照管读数高于有酶对照管和标曲，则实验无效，联系厂家。
14.如果有酶对照管和标曲有读数，无酶对照管、无显色液对照管读数分别低于有酶对照管和标曲，则整个实验有效，可以继续分析N个待测样本的结果。
15.将标曲的所有读数都减去无显色液对照的读数，然后绘制标准曲线。纵坐标是OD660读数，横坐标是磷酸盐标准品的nmol数。
16.将每个测样本的有底物测试数值减去这个样本的背景读数（背景读数是从该样本的无底物测试读数和整个实验的无显色液对照读数中，选最高的一个而得）得到有效读数，用此有效读数从标准曲线上推算出该样本释放的磷酸的nmol数。
17.如果样本的OD660数值在标曲范围之外，则需要稀释样本，直到其数字在标曲范围之内。具体稀释多少倍，需要自行摸索。
18.根据样本释放磷酸的nmol数，按下面的公式计算ATPase的活性。待测样本ATPase的活性（U/mL）=(磷酸释放nmol数*稀释倍数)/(ATPase反应时长30分钟*ATPase反应加入的样本微升数)。如果样本没有稀释，则稀释倍数为1。

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