CAT#:JW-990102-50
低温运输，-20℃保存

染料法qRT-PCR试剂盒

产品及特点
本产品是基于荧光染料检测的即用型RT-PCR试剂盒，可以对靶RNA分子进行实时定量RT-PCR分析（quantitative RT-PCR、qRT-PCR）。产品含有经过优化的缓冲液组分、逆转录酶、热启动Taq DNA聚合酶、Taq DNA稳定剂、dNTPs、MgCl2和稳定剂等所有染料法qRT-PCR所需要的成分，用户只需加入RNA模板和引物即可进行染料法实时定量RT-PCR反应，具有广泛的用途。本产品具有下列特点：
1.即开即用，用户只需准备模板、引物和ROX染料（取决于qPCR仪器）即可以进行染料法实时定量RT-PCR实验，非常方便快捷，降低了操作误差。
2.各成分的浓度和比例都经过精心优化，用户不需要再优化反应。
3.反应的灵敏度高，最高时可以达到50拷贝/反应（跟模板质量，引物设计等相关）。
4.灵敏度和专一性比常规RT-PCR更高。
5.可用于基因表达分析、SNP分析、拷贝数分析等实验。
6.既可用于定性，也可用于定量。
7.本产品足够50次20uL体系的染料法qRT-PCR反应。
8.本产品只能用于科研，

规格及成分
本产品用塑料袋包装
成份                                                编号          规格       包装材料
2×染料法qRT-PCR缓冲液            990102a    500 uL    0.5mL棕色管
10×染料法qRT-PCR酶混合液      990102b    100 uL    0.5mL红色盖
使用手册                                      990102sc    1份            无

运输及保存
低温运输，-20℃保存, 不冻融时保存期限为12个月。如果需要每天使用，可在4℃放置三周。

自备试剂
RNA模板、引物、超纯水。

使用方法
1.如果有N个样品并且做定量分析，最好设置N+7个反应，多出的7个中，6个是做标准曲线的阳性对照，一个是阴性对照（NC）。在N+7个PCR管中，加入下列成分。如果是做定性分析，则6个做标准曲线的样品缩减成一个阳性对照（PC），用户自己需要根据下表进行适当修改（把6个标曲反应改成1个阳性对照反应）。
成分                                       N个样品管        6个标准曲线管              NC管
2×染料法qRT-PCR缓冲液          各10 uL          各10 uL                       10 uL
自备引物1（10uM）                   各1 uL            各1 uL                         1 uL
自备引物2（10uM）                    各1 uL           各1 uL                           1 uL
N个自备模板RNA                         各1-2 uL        不加                             不加
自备阳性对照模板（6个梯度）    不加        各1 uL（1管加1个梯度）    不加
阴性对照模板（水）                    不加               不加                                1 uL
自备50×ROX I染料
或
自备50×ROX II染料（见注）       各0.4 uL        各0.4 uL            0.4 uL
10×染料法qRT-PCR酶混合液        2 uL                2 uL                    2 uL
补超纯水到                                    20 uL                20 uL               20 uL

注，下列信息仅供参考，具体以qPCR仪器的使用手册为准。
A、不需要ROX的机型：Agilent MX3000和MX4000、iCycler IQ、LightCycler 480、，、Smart Cycler System、Thermal Cycler Dice Real Time System等型号的荧光PCR仪器不需要加ROX染料，但加入的话也不会影响整个PCR分析。
B、需要使用ROX I的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step One、Step One Plus。
C、需要使用ROX II的机型：ABI Prism7500、7500 Fast、MJ Opticon、MJ Chromo4、Corbett RotorGene 3000。
2.放入荧光PCR仪中进行扩增, 下表的扩增参数仅供参考，一定需要根据靶分子长度，引物的Tm值等进行调节。一般选择三步法PCR：
步骤                            反应参数        备注
逆转录（RT步骤）     50℃ 30分钟    
预变性                         94℃ 2分钟    
PCR（35-45次循环）    94℃ 15秒    
                            55-65℃ 15-30秒    在此步采集FAM通道的荧光信号
                                        72℃ 30秒    
如果引物Tm值接近60℃，也可以选择两步法PCR：
步骤                               反应参数        备注
逆转录（RT步骤）    50℃ 30分钟    
预变性                          94℃ 2分钟    
PCR（35-45次循环）    94℃ 15秒    
                                   60℃ 30-60秒    在此步采集FAM通道的荧光信号
3.数据处理
如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性。一般情况下，阴性对照Ct大于或等于40（阈值需要以阴性对照的Ct值确定，此处为便于叙述以40为例，具体情况很可能阈值不一样）。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。

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