CAT#:JW-990408-1
低温运输，-20℃保存

2×染料法qPCR MasterMix

产品及特点
本产品是基于荧光染料检测的即用型PCR试剂盒，可以对靶片段进行实时定量 PCR 分析。产品含有经过优化的缓冲液组分、Taq DNA 聚合酶、 dNTPs、MgCl2及 SYBR Green I等所有实时定量PCR所需要的成分，用户只需加入模板和引物即可进行实时定量PCR反应，具有广泛的用途。本产品具有下列特点：,
1.方便，用户只需准备模板和引物即可以进行实时定量PCR实验。
2.产品为2×预配液，操作步骤已经最大限度地简化，能减少污染，降低实验误差。
3.扩增效率和灵敏度更高。
4.快捷，即用型的预配液使加样操作步骤简化，避免了交叉污染，降低实验误差。
5.各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。。
6.本规格有1mL，足够100次20 uL体系的染料法荧光定量PCR。
7.本产品只供科研使用。

规格及成分
本产品采用塑料袋包装
成份                                           编号        规格        包装
2×染料法qPCR MasterMix    990408       1 mL    1mL本色管
使用手册                                990408sc    1份        1份

运输及保存
低温运输，-20℃保存, 有效期一年。

自备试剂
DNA模板、引物、超纯水。

使用方法
1.如果有N个样品（最好含一个样本制备阳性对照和一个样本制备阴性对照）并且做定量分析，最好设置N+7个反应，多出的7个中，6个用于6点标准曲线，一个是扩增阴性对照（NC）。在N+7个PCR管中，加入下列成分。如果是做定性分析，则6个做标准曲线的样品缩减成一个扩增阳性对照（PC），用户自己需要根据下表进行适当修改（把6个标曲反应改成1个阳性对照反应）。
成分                                       N个样品管        6个标准曲线管     NC管
2×染料法qPCR MasterMix        各10uL            各10uL              10uL
自备引物1（10uM）                 各1uL               各1uL                1uL
自备引物2（10uM）                 各1uL               各1uL                1uL
自备模板DNA            
基因组DNA                            10-100ng               不加                    不加
或cDNA                                    1-10ng                不加                     不加
自备阳性对照模板（6 各梯度）    不加                各 1 uL                不加
阴性对照模板(一般用水)                不加               不加                      1uL
自备 50×自备 ROX I或 ROX II 染料(见附)    各0.4uL    各0.4uL        0.4uL
补超纯水到                                    20uL               20uL                     20uL
2.放入荧光PCR仪中进行扩增, 下表的扩增参数仅供参考。
循环步骤            反应参数               备注
预变性                   95℃                5分钟    
PCR
（35-45次循环）    94℃                 10秒    
                    55-65℃     15-30秒    靶分子长度最好在 80-200bp
                        72℃ 40秒            （采集SYBR通道的荧光信号）
溶解曲线分析    按qPCR仪器手册执行
3.通过溶解曲线分析的结果排除无效数据。有Ct值，但Tm值跟扩增阳性对照Tm不一样的样品（包括对照和待测样品），归为假阳性，数据无效，不予以分析。Tm跟扩增阳性对照Tm一致的，为有效Ct。
4.如果两种阴性对照（样本制备阴性对照和扩增阴性对照）的溶解曲线所得Tm值跟扩增阳性对照的Tm值一样，说明环境或试剂可能有过去的PCR扩增产物污染，则此次实验无效，需要解决污染问题再进行实验。
5.如果两种阴性对照（样品制备阴性对照和PCR阴性对照）是假阳性，可以继续分析其它样品有效数据。
6.对定量检测，以6个标准曲线样品的浓度的log值为横轴，以有效Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的有效Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再换算出待测样品的DNA浓度。
7.对定性检测，则得到有效Ct值的样本为阳性，无有效Ct值的为阴性。

附：
下列信息仅供参考，具体以 qPCR 仪器的使用手册为准。
1．不需要 ROX 的机型：Agilent MX3000 和 MX4000、iCycler IQ、LightCycler 480、 Smart Cycler System、Thermal Cycler Dice Real Time System 等型号的荧光 PCR 仪器不需要加 ROX 染料，但加入的话也不会影响整个 PCR 分析。
2. 需要使用 ROX I 的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step One、Step One Plus。
3. 需要使用 ROX II 的机型：ABI Prism7500、7500 Fast、MJ Opticon、MJ Chromo4、 Corbett RotorGene 3000。

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