CAT#:JW-990504
低温运输，-20℃保存

探针法qRT-PCR试剂盒

产品及特点
本产品是基于荧光探针检测的即用型RT-PCR试剂盒，可以对靶RNA分子进行实时定量RT-PCR分析（quantitative RT-PCR、qRT-PCR）。产品含有经过优化的缓冲液组分、逆转录酶、热启动Taq DNA聚合酶、Taq DNA稳定剂、dNTPs、MgCl2和稳定剂等所有实时定量RT-PCR所需要的成分，用户只需加入RNA模板、引物和探针即可进行探针法实时定量RT-PCR反应，具有广泛的用途。本产品具有下列特点：
1.以2×Mix提供，用户只需准备模板、引物、探针和ROX染料（取决于qPCR仪器）即可以进行探针法实时定量RT-PCR实验，非常方便快捷，降低了操作误差。
2.各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。灵敏度最高时可以达到50拷贝/反应（跟模板质量，引物设计等相关）。
3.既可用于TaqMan探针qRT-PCR，也可以是分子信标（molecular beacon）的qRT-PCR。
4.灵敏度和专一性比染料法荧光定量RT-PCR更高。
5.可用于基因表达分析、SNP分析、拷贝数分析等实验。也可以用于定性检。
6.本产品只能用于科研，1 mL足够100次20 μL体系的探针法qRT-PCR反应。

规格及成分
本产品采用塑料袋包装
成分                                        编号       规格            包装材料
探针法qRT-PCR缓冲液       990504a    500 μL    0.5 mL蓝盖管
探针法qRT-PCR酶混合液    990504b    100 μL    0.5 mL红盖管
使用手册                            990504sc    1份           1份

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂
RNA模板、引物、TaqMan探针、超纯水。

使用方法
一、如果有N个样品并且做定量分析，最好设置N+7个反应，多出的7个中，6个是做标准曲线的阳性对照，一个是阴性对照（NC）。在N+7个PCR管中，加入下列成分。如果是做定性分析，则6个做标准曲线的样品缩减成一个阳性对照（PC），用户自己需要根据下表进行适当修改（把6个标曲反应改成1个阳性对照反应）。
成分                                N个样品管        6个标准曲线管        NC管
探针法qRT-PCR缓冲液    各10 μL           10 μL                       10 μL
自备引物1（10 μM）        各1 μL            各1 μL                       1 μL
自备引物2（10 μM）        各1 μL            各1 μL                       1 μL
N个自备模板RNA            各1-2 μL            不加                        不加
自备阳性对照模板（6个梯度）    不加        各1 μL（1管加1个梯度）    不加
阴性对照模板（水）        不加                不加                1 μL
自备探针（5 μM）            各1 μL           各1 μL                1 μL
自备50×ROX I染料或自备50×ROXII染料（见注）    各0.4 μL    各0.4 μL    0.4 μL
探针法qRT-PCR酶混合液    2 μL            2 μL                2 μL
补超纯水到                        20 μL           20 μL                20 μL
注，下列信息仅供参考，具体以qPCR仪器的使用手册为准。
1、不需要ROX的机型：AgilentMX3000和MX4000、iCycler IQ、LightCycler 480、SmartCycler System、Thermal Cycler Dice RealTime System等型号的荧光PCR仪器不需要加ROX染料，但加入的话也不会影响整个PCR分析
2、需要使用ROXI的机型：ABIPrism7000、7300、7700、7900HT、Step One、Step One Plus。
3、需要使用ROXII的机型：ABIPrism7500、7500Fast、MJ Opticon、MJ Chromo4、CorbettRotorGene3000。

二、放入荧光PCR仪中进行扩增, 下表的扩增参数仅供参考，一定需要根据靶分子长度，引物和探针的Tm值、标记染料的种类等进行调节。一般选择三步法PCR：盖上盖子后上机，按下面参数进行RT-PCR：
步骤                               反应参数        备注
逆转录（RT步骤）        50℃             30 min
预变性                           94℃               2 min
PCR反应（45个循环）    95℃            15 sec
                                    60℃                60 sec（采集FAM通道的荧光信号，淬灭基团为TAMRA）

三、数据处理
1.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性。一般情况下，阴性对照Ct大于或等于40（阈值需要以阴性对照的Ct值确定，此处为便于叙述以40为例，具体情况很可能阈值不一样）。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。

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