CAT#:JW-980817-25
常温运输和保存

mRNA纯化试剂盒(Oligo-dT纤维素法)

产品及特点
mRNA只占细胞总RNA的3%左右，但却是最重要的RNA，因为它们编码蛋白质。因此构建cDNA文库、、蛋白质体外翻译和 RT-PCR 检测等研究常常都需要从总 RNA中先分离mRNA。 真核mRNA带 有poly（A）尾巴，所以可以通过与 Oligo（dT）纤维素的亲和结合而与其他97%左右的非编码RNA（如rRNA、tRNA等）分离开。本产品就是基于此原理开发的、专门用于从总RNA中提取mRNA的试剂盒。它具有下列特点：
1.一站式，，即开即用，非常方便。
2.一次可以处理约10-15 ug总RNA，从中可得0.1-0.5 ug左右的mRNA。
3.每克Oligo（dT）纤维素可以吸附50-80 OD的mRNA，相当于2000-3000 ug mRNA。
4.只需要离心就可以完成，免去了常规的灌柱、洗柱等繁琐操作。
5.得到的mRNA可以直接用于构建cDNA文库、蛋白质的体外翻译和RT-PCR。
6.本试剂盒足够25次微量mRNA提取实验。

规格及成分
本产品用小扁盒包装
成分                                    编号            规格        包装材料
mRNA/Oligo-dT结合液        980817a    100 mL    120 mL本色瓶
Oligo-dT纤维素（悬液）     980817b     25 mg     1.5 mL本色管
Oligo-dT纤维素保存液        980817c     10mL       10 mL本色瓶
RNase-free水                     980403       10 mL      10 mL本色瓶
微量核酸沉淀剂                  220313       10 mL      10 mL本色瓶
使用手册                             980817sc    1份               无

运输及保存
常温运输，收到货后Oligo(dT)纤维素最好放-20℃长期保存，有效期一年。

自备试剂
75%乙醇

使用方法
1.涡旋震荡取Oligo -dT纤维素悬液，迅速取50 uL Oligo -dT纤维素悬液（相当于5mg干粉）到1个新的1.5mL离心管中，剩余的Oligo-dT纤维素重悬液放4℃长期保存。
2.洗涤：在50uL的Oligo -dT纤维素重悬液中加入0.5 mL mRNA/Oligo-dT结合液（以下简称结合液）混匀，10000g离心3分钟，去上清。
3.在Oligo -dT纤维素沉淀中加入0.5 mL结合液，吹打混匀，10000g离心3分钟，去上清，所得Oligo -dT纤维素沉淀待用。
4.将自备的总RNA取100uL 65℃保温5分钟，以打开mRNA可能的二级结构。未用的总RNA-80℃保存作为未处理的对照。如果总RNA体积不足100 uL，则用RNase-free水补足到120uL并混匀，留20uL做作为未处理的对照，剩下的100uL 65℃保温5分钟。
5.保温结束后立即加入等体积（100uL）的结合液，用移液抢充分吹打混匀。
6.将混合液全部转移到第2步所得的Oligo-dT纤维素沉淀中，用移液抢充分吹打重悬Oligo-dT纤维素，室温放置5分钟。期间吹打混匀或者涡旋混匀数次以便让mRNA与Oligo-dT纤维素充分结合。
7.室温10000 g离心5分钟，小心将上清转移到一个新的离心管中。此上清液是去除了mRNA后的总RNA，-80℃保存作为后续分析时的无mRNA对照。如果mRNA回收失败，可以再次将其用于mRNA纯化。
8.洗涤：加入0.5 mL结合液，混匀后4℃ 10000g离心5分钟，小心弃上清。
9.重复上步3次。
10.加入50 uL 冰上预冷的RNase-free 水，充分吹打混匀后 4℃ 10000 g 离心5分钟，小心收集上清（mRNA）。
11.重复上步 1次。
12.将两次收集的mRNA混合，即为100uL mRNA溶液。
13.由于mRNA只占总RNA的3%左右，100ug总RNA最多只能得到3ug mRNA，溶解在100uL水中，浓度也只有30ng/uL。所以如果需要浓缩mRNA，可以按下面附1操作进行。本试剂盒含相关试剂。
14.第11步剩下的Oligo-dT纤维素可以再生后重复使用。一般可以重复使用至少5次。再生的流程见附录2。本试剂盒含部分相关试剂。

附1：mRNA的浓缩
15.将微量核酸充分摇匀（静止太久有沉淀，属于正常现象），立即取200uL与 100uL mRNA 溶液混合。
16.室温15000g离心10分钟。
17.弃上清，小心不要吸走沉淀（mRNA）。
18.加入自备的75%乙醇1 mL，振荡10秒混匀。
19.15000g离心3分钟，弃上清，小心不要吸走沉淀（mRNA沉淀）。
20.再短暂离心后小心吸弃残留上清（约50uL）。
21.沉淀即为回收的mRNA沉淀，不要长期放置（否则晾干太长时间mRNA不容易溶解），立即加入适量的RNase-free 水溶解mRNA。mRNA可用于后续实验，或放-80℃保存。

附2：Oligo-dT纤维素的再生
22.加入1mL 0.3mol/L的NaOH到第12步取走mRNA上清后剩下的Oligo-dT纤维素沉淀中，吹打重悬后室温放置5分钟，此步可以降解所有残留的RNA。
23.离心吸弃NaOH溶液。
24.用结合液洗涤Oligo-dT纤维素直到pH变成中性（用pH试纸检测）。
25.加入250uL Oligo-dT纤维素保存液放4℃长期保存。
26.用前需离心去掉Oligo-dT纤维素保存液。
27.用结合液洗涤3次。
28.重悬在100uL结合液中，然后切入到第3步。

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