CAT#:JW-981201
低温运输，-20℃保存

2×探针法qPCR MasterMix

产品及特点
本产品是基于荧光探针检测的即用型PCR试剂盒，可以对靶片段进行实时定量PCR分析（quantitative PCR、qPCR）。产品含有经过优化的缓冲液组分、热启动Taq DNA聚合酶、Taq DNA稳定剂、dNTPs、MgCl2和稳定剂等所有实时定量PCR所需要的成分，用户只需加入基因组DNA或cDNA模板、引物和探针即可进行探针法实时定量PCR反应，具有广泛的用途。本产品具有下列特点：
1.以2×Mix提供，用户只需准备模板、引物、探针和ROX染料（取决于qPCR仪器）即可以进行探针法实时定量PCR实验，非常方便快捷，降低了操作误差。
2.各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。灵敏度最高时可以达到50拷贝/反应（跟模板质量，引物设计等相关）。
3.既可用于TaqMan探针qPCR，也可以是分子信标（molecμLar beacon）探针qPCR。
4.灵敏度和专一性比染料法荧光定量PCR更高。
5.可用于基因表达分析、SNP分析、拷贝数分析等实验。也可以用于定性检测。
6.本产品反复冻融20次对扩增效果没有任何影响。
7.本产品足够100次20 μL体系的探针法qPCR反应。
8.本产品只能用于科研。

规格及成分
成份                                            编号        规格        包装
2X探针法qPCR MasterMix    981201       1 mL    1.5 mL本色盖
使用手册                                981201sc    1份        1份
本产品采用塑料袋包装

运输及保存
低温运输，-20℃保存, 不冻融时保存期限为24个月。如果需要每天使用，可在4℃放置三周。

自备试剂
DNA模板、引物、超纯水。

使用方法
1.如果有N个样品并且做定量分析，最好设置N+7个反应，多出的7个中，6个是做标准曲线的阳性对照，一个是阴性对照（NC）。在N+7个PCR管中，加入下列成分。如果是做定性分析，则6个做标准曲线的样品缩减成一个阳性对照（PC），用户自己需要根据下表进行适当修改（把6个标曲反应改成1个阳性对照反应）。
成分                                                              N个样品管        6个标准曲线管            NC管
2×探针法qPCR MagicMix                                各10 μL           各10 μL                     10 μL
自备引物1（10 μM）                                       各1 μL             各1 μL                        1 μL
自备引物2（10 μM）                                       各1 μL             各1 μL                         1 μL
自备模板DNA            
基因组DNA                                                   10-100 ng             不加                           不加
或cDNA                                                             1-10 ng            不加                            不加
自备阳性对照模板（6各梯度）                           不加      各1 μL（各加1个梯度）       不加
阴性对照模板（一般用水）                                 不加                    不加                       1 μL
自备探针（0.5 μM）                                            各1 μL                各1 μL                    1 μL
自备50×自备ROX I或ROX II染料（见注）          各0.4 μL             各0.4 μL                  0.4 μL
补超纯水到                                                           20 μL                   20 μL                    20 μL
2.放入荧光PCR仪中进行扩增, 下表的扩增参数仅供参考，一定需要根据靶分子长度，引物和探针的Tm值、标记染料的种类等进行调节。一般选择三步法PCR：
步骤                                反应参数                备注
预变性                               94℃ 2 min    
PCR（35-45次循环）    94℃ 15 sec            靶分子长度最好在80-200 bp
                               55-65℃ 15-30 sec           在此步采集荧光信号，通道根据标记染料决定
                                        72℃ 30 sec    
如果引物Tm值接近60℃，也可以选择两步法PCR：
步骤                                   反应参数                备注
预变性                               94℃ 2 min    
PCR（35-45次循环）    94℃ 15 sec           靶分子长度最好在80-200 bp
                                       60℃ 60 sec           在此步采集荧光信号，通道根据标记染料决定
3.数据处理
如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性。一般情况下，阴性对照Ct大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。

附：
下列信息仅供参考，具体以qPCR仪器的使用手册为准。
1.不需要ROX的机型：Agilent MX3000和MX4000、iCycler IQ、LightCycler 480、，、Smart Cycler System、Thermal Cycler Dice Real Time System等型号的荧光PCR仪器不需要加ROX染料，但加入的话也不会影响整个PCR分析。
2.需要使用ROX I的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step One、Step One Plus。
3.需要使用ROX II的机型：ABI Prism7500、7500 Fast、MJ Opticon、MJ Chromo4、Corbett RotorGene 3000。

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