CAT#:JW-240315
低温运输，-20℃保存

液体样本NAD+浓度测定试剂盒（WST-8/1-mPMS法）

产品及特点
NAD+ (Nicotinamide Adenine Dinucleotide, 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，氧化型辅酶I) 是氧化还原反应的经典辅酶，广泛存在于几乎所有细胞内，参与500多个细胞内生化反应，包括能量代谢、氧化还原稳态、表观遗传调控、昼夜节律、自噬、DNA修复、基因组稳定、细胞信号传递等。在包括人类在内的多种生物中，衰老伴随着细胞和组织NAD+水平的逐渐下降。因此准确测定生物体内NAD+的浓度具有重要的意义。本产品是以在MTT/PMS版本的基础上改进而来，基于WST-8/1-mPMS检测检测原理，该原理示意图如下：

它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样本。
2.可以用液体样本为起始材料，如血清，血浆，细胞培养液上清，细胞裂解液上清等等。
3.WST-8比老版的MTT溶解度更高， mPMS比老版的PMS光稳定性更好。
4.灵敏性高，可以检测的最低浓度为0.20 μM的NAD+，而人血浆中NAD+浓度一般在30 μM左右。
5.线性范围为0.20 μM-10 μM，浓度高于此范围上限的需稀释后测定。
6.本产品足够100次100 μL体系的微孔板测试。
7.本产品不能测定NADH和NAD+/NADH的比例，需要另购相关产品。
8.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品采用小扁盒包装
成分                                            编号        规格           包装
NAD+提取液A                        240315a    30 mL    30 mL本色瓶
NAD+提取液B                        240315b    75 mL    75 mL本色瓶
NAD+标准品溶液（1mM）    240315c    250 uL    0.5 mL棕色管
乙醇底物溶液                         240315d    250 uL    0.5 mL蓝盖管
乙醇脱氢酶溶液                     240315e     250 uL    0.5 mL红盖管
乙醇脱氢酶反应液                 240315f      5 mL       5 mL本色瓶
WST-8/1-mPMS溶液             240315g     1mL        1.5 mL棕色管
使用手册                                 240315sc    1份        无

运输及保存
低温运输，NAD+标准品溶液、乙醇脱氢酶溶液和WST-8/1-mPMS溶液需要放-20℃保存，其余成分可以放4-8℃保存，保存期限为12个月。

自备物品
超纯水。

使用方法
一、提取液体样本中的NAD+
1.在1.5 mL带螺旋盖的离心管中，加入1 mL液体样本和3.5 mL NAD+提取液A，混匀，50℃保温10分钟，冰上冷却后加入适量（750 μL左右） 体积的NAD+提取液B，混匀，直到用pH试纸测定pH在中性范围，然后12,000 g 4℃离心10分钟，转移上清到新离心管中，放冰上待用。
2.第一次测试时，可以根据文献数据，将待测液体样本稀释到本产品的线性范围进行预实验。比如，如果样本是测人血液，血液NAD+浓度一般在30 μM左右（不同方法测定会有差异），故可以将样本分别稀释6倍（0.1 mL样本加0.5 mL水）和30倍（0.1 mL 6倍稀释后的样本加0.4 mL 水），然后再测定。后续实验可以根据本次预实验结果，选择6倍稀释液还是30倍稀释液作为待测样本。

二、NAD+标准曲线样本的制备
3.在1.5 mL离心管中，加入990 μL自备超纯水和10 μL的1 mM浓度NAD+标准品溶液（本试剂盒提供），涡旋震荡混匀，得到10 μM NAD+标准品溶液。
4.标记1-6号共6个1.5 mL离心管，分别加入500 μL超纯水。
5.在1号管中加入500 μL的10 μM NAD+标准品溶液，涡旋震荡30秒混匀，得到5 μM NAD+标准品溶液。此为1号标准曲线样本。
6.在2号管中加入500 μL上步所得的1号标准曲线样本，涡旋震荡30秒混匀，得到2.5 μM NAD+标准品溶液。此为2号标准曲线样本。
7.在3号管中加入500 μL上步所得的2号标准曲线样本，涡旋震荡30秒混匀，得到1.25 μM NAD+标准品溶液。此为3号标准曲线样本。
8.按此方法操作，直到得到6号标准曲线样本。
9.上述1-6号标准曲线样本的浓度分别是5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156 μM，放冰上待用。

三、NAD+检测工作液的准备
10.如果有N个待测样本，每个样本测1次重复，做6点标曲，每个点做1次重复，则共N+6个测试。如果样本多，需要算上损耗，按N+6+1的量按下表配制所需体积的工作液：
                                   1次测试所需量
乙醇脱氢酶反应液            36 μL
乙醇底物溶液                    2 μL
乙醇脱氢酶溶液                2 μL
WST-8/1-mPMS溶液        10 μL
11.涡旋混匀后放冰上待用。

四、NAD+测试反应
12.按下表在透明96孔板中分别加入各成分，最后加入NAD+检测工作液：
                                空白对照孔    待测样品孔N个    标准曲线孔6个
自备超纯水                      50 μL                -                           -
N个待测样品                        -                各50 μL                   -
NAD+标准品溶液（6个）    -                   -                   各50 μL（1号标曲样本加入1号孔，2号加入2号孔，以此类推）
NAD+检测工作液               50 μL            50 μL                50 μL
13.室温孵育10-30分钟。
14.待反应完成后，利用酶标仪测定450 nm波长下的吸光度。

四、数据处理
15.利用标准品浓度为横坐标，450 nm波长下的吸光度值为纵坐标制作标准曲线，并获得横纵坐标之间的函数关系式，然后利用标准曲线和各样品的吸光度值计算出样品中NAD+浓度。下图是一个典型NAD+标准曲线，供参考：

16.如果样本中NAD+浓度偏低，可以适当延长反应时间。如果浓度超过仪器的检测极限，则适度稀释样本，直到读数在有效范围。

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