CAT#:JW-990505-1
低温运输，-20℃保存

2×探针法Tth qRT-PCR MasterMix

产品及特点
本产品是基于Tth DNA聚合酶的荧光探针法RT-PCR MasterMix，它含有经过优化的缓冲液组分、Tth DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2等所有实时定量RT-PCR所需要的成分。与常用的MMLV-Taq DNA酶RT-PCR体系相比，它们的区别如下：

本产品具有下列特点：
1.方便，用户只需准备模板、引物和探针即可以进行探针法qRT-PCR实验。
2.产品为2×预配液，操作步骤已经最大限度地简化，能减少污染，降低实验误差。
3.60-70℃进行RT-PCR，避免了RNA二级结构打不开问题和非特异扩增问题。
4.各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。
5.本规格有1mL，足够100次20uL体系的探针法荧光定量RT-PCR。
6.比进口同类产品性价比更高。
7.本系列产品只可用于科研。

规格及成分
本产品采用塑料袋包装
成分                                                    编号            规格        包装
2×探针法Tth qRT-PCR MasterMix    990505        1 mL    1.5mL棕色管
使用手册                                            990505sc    1份        无

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂
待测RNA模板、阳性对照RNA模板、引物、探针、超纯水。

使用方法
1.按下表设置探针法Tth qRT-PCR反应，以一个样本为例：
成分                                                    样品管       阴性对照    阳性对照
2×探针法Tth qRT-PCR MasterMix     10 μL            10 μL        10 μL
自备引物1和引物2（10μM each）     各1μL           各1μL        各1μL
TaqMan探针（5μM）                         1μL               1μL           1μL
自备模板RNA（100ng-1μg）             1-2μL        
阳性对照RNA模板（100ng-1μg）                          1-2μL    
补超纯水到                                         20μL            20μL            20μL
2.放入荧光PCR仪中进行扩增，下表的扩增参数仅供参考，一般需要根据靶分子长度，引物的Tm值等进行调节。一般选择三步法PCR：
步骤                               温度           时间
逆转录（RT步骤）       60-70℃    30 min（具体温度根据引物Tm决定）
预变性                            95℃        3 min
PCR（35-45次循环）    95℃        15 sec
                                    55-65℃    15-30 sec
                                       72℃       30 sec（根据探针的荧光标记选择对应的荧光通道）
如果引物Tm值接近60℃，也可以选择两步法PCR：
步骤                               温度             时间
逆转录（RT步骤）        60-70℃      30 min（具体温度根据引物Tm决定）
预变性                            95℃           3 min
PCR（35-45次循环）    95℃           15 sec
                                        60℃           60 sec（根据探针的荧光标记选择对应的荧光通道）
3.定量分析数据处理：以6个10倍稀释的标准曲线样本的浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
4.定性分析数据处理：阴性对照Ct大于或等于40（此处为便于叙述姑且以40为例，具体设置成多少需要用户根据引物探针的具体情况测试确定）。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于40。如果对照结果不能满足上述条件，则实验无效，不需要分析待测样本数据。如果满足上述条件，表示实验有效，则可以继续分析待测样本。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于40则为阳性。

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