CAT#:JW-900903
低温运输，-20℃保存

AFLP试剂盒（EcoRI-MseI）

产品及特点
AFLP（amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性）原理是一种结合RFLP和PCR技术特点的一种分子标记分型技术，其原理如下：

本产品在传统AFLP-PCR的基础上经过精心优化而开发，它具有下列特点：
1.一站式，足够50次酶切-连接反应、50次预扩反应和1500次AFLP PCR（30 μL体系计算），但不包括DNA纯化和带型分析试剂（如PAGE电泳试剂和银染试剂）。
2.本产品提供EcoRI-MseI组合，适用于GC含量在50%以上的基因组。对GC含量在50%以下的基因组，需从本公司另外采购EcoRI-TaqI组合的AFLP试剂盒。
3.各种参数都经过优化，一次PCR所得AFLP片段数一般在10-100之间，可重复性好，误差小于0.6%。
4.本产品适用于基因组在500 Mb-6000 Mb的材料（如动物和植物）。对于基因组在50-500 Mb的材料（如细菌和真菌）或50Mb以下的材料（如质粒，cosmid，BAC，YAC和PAC等），需要分别另购+0型预扩增引物对和+2型扩增引物。
5.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品采用小扁盒包装
成份                                                    编号           规格        包装
AFLP酶切-连接-预扩增相关成分    900903pt1       50 次    十孔盒
AFLP +3型EcoRI引物系列            900903pt2        8 条      十孔盒
AFLP +3型MseI引物系列             900903pt3         8 条      十孔盒
AFLP PCR成分                            900903pt4         5 mL×6    热封塑料袋
使用手册                                      900903sc          1 份           无

上述成分详情见下列表格
第一个十孔盒成分编号为：900903pt1，名称为：AFLP 酶切-连接-预扩增相关成分
成份                                            编号            规格            包装
AFLP酶切-连接Buffer，10×       900903a     100 μL    0.5 mL绿盖管
AFLP EcoRI-MseI酶混合液       900903b      50 μL      0.5 mL红盖管
AFLP EcoRI-MseI接头干粉       900903c1    50 次      1.5 mL紫盖管
AFLP EcoRI-MseI接头溶解液    900903c2    1 mL      1.5 mL黄盖管
+1型EcoRI-MseI预扩增
引物干粉                          900903d    40 次    0.5 mL白盖管×4
T4 DNA连接酶，5U/μL    120411      50 μL    0.5 mL蓝盖管

第二个十孔盒成分编号为：900903pt2，名称为：AFLP +3型EcoRI引物系列
成份                                编号        规格          包装
E-AAC引物干粉    900903pt2-1    1 OD    1.5 mL本色压盖管
E-AAG引物干粉    900903pt2-2    1 OD    1.5 mL本色压盖管
E-ACA引物干粉    900903pt2-3    1 OD    1.5 mL本色压盖管
E-ACT引物干粉    900903pt2-4    1 OD    1.5 mL本色压盖管
E-ACC引物干粉    900903pt2-5    1 OD    1.5 mL本色压盖管
E-ACG引物干粉    900903pt2-6    1 OD    1.5 mL本色压盖管
E-AGC引物干粉    900903pt2-7    1 OD    1.5 mL本色压盖管
E-AGG引物干粉    900903pt2-8    1 OD    1.5 mL本色压盖管

第三个十孔盒成分编号为：900903pt3，名称为：AFLP +3型MseI引物系列
成份                                编号        规格            包装
M-CAA引物干粉    900903pt3-1    1 OD    1.5 mL本色压盖管
M-CAC引物干粉    900903pt3-2    1 OD    1.5 mL本色压盖管
M-CAG引物干粉    900903pt3-3    1 OD    1.5 mL本色压盖管
M-CAT引物干粉    900903pt3-4    1 OD    1.5 mL本色压盖管
M-CTA引物干粉    900903pt3-5    1 OD    1.5 mL本色压盖管
M-CTC引物干粉    900903pt3-6    1 OD    1.5 mL本色压盖管
M-CTG引物干粉    900903pt3-7    1 OD    1.5 mL本色压盖管
M-CTT引物干粉    900903pt3-8    1 OD    1.5 mL本色压盖管


热封塑料袋成分编号为：900903pt4，名称为：AFLP PCR成分
成份                                                    编号    规格            包装
2×PCR MasterMix（含示踪剂）    990805    5 mL×6    5 mL本色瓶

运输及保存
低温运输、-20℃保存，有效期一年。

自备物品
超纯水、Southern级DNA纯化试剂，尿素-PAGE电泳套装，银染试剂盒。

使用方法
一、DNA提取（本试剂盒不提供相关试剂）
1.用户需要自备50-500ng Southern级别的基因组DNA。DNA酶切彻底是AFLP成功的关键，所以最好先预实验以确保DNA能够被EcoRI和MseI内切酶彻底切开。

二、限制性内切酶酶切和DNA-接头连接反应（本试剂盒足够50次20μL体系的酶切-连接反应）
2.在0.2mL离心管中设置20μL的限制性内切酶酶切反应：
加入成分                                                                                用量
AFLP酶切-连接Buffer，10×                                                   2μL
样品DNA    50ng（对小基因组材料）
500ng（对大基因组材料）AFLP EcoR I-Mse I酶混合液        1μL
自备超纯水                                                                            加水到20μL
3.轻柔混匀并短暂离心后，37℃保温2小时酶切（若PCR仪器不带热盖，则必须加50mL自备石蜡油，否则水分会蒸发影响反应。下同）。反应结束后70℃保温15分钟灭活酶。
4.在体系中加入20μL AFLP EcoRI-MseI接头混合物和1μL T4 DNA连接酶，5U/mL，轻柔混匀并短暂离心，20℃保温3小时让接头跟酶切DNA片段连接。第一次使用本试剂盒时，需要把本试剂盒提供的1mL AFLP EcoRI-MseI接头溶解液加入到AFLP EcoRI-MseI接头干粉管，涡旋震荡半分钟，短暂离心，然后再取用。没有用完的需要放-20℃保存。
5.反应结束后直接在40μL的连接反应体系中加入自备360μL超纯水，得到连接液10倍稀释液，直接作为模板用于下步的预扩增或放-20℃保存待用。

三、预扩增（本试剂盒足够40次30μL体系的预扩增反应）
6.在0.2mL离心管中设置30μL的预扩PCR体系。首次使用本试剂盒时，需要在本试剂盒提供的+1型EcoRI-MseI预扩增引物干粉管中加入100μL自备超纯水，涡旋震荡半分钟混匀，短暂离心后直接取用。没有用完的部分，需要放-20℃保存：
成分                                                          体积
连接液10倍稀释液（来于第4步）             5 μL
+1型EcoRI-MseI预扩增引物                    10 μL
2×PCR MasterMix                                   15 μL
7.离心数秒，按下列参数进行PCR预扩增（注意：第一步是预合成，跟常规PCR不同）：预合成72℃ 2分钟，PCR循环20次（94℃30S，56℃60S，72℃60S）
8.取10μL PCR产物在1.5%琼脂糖胶上电泳检测，产物应为大小在100-1500bp的模糊条带。本试剂盒的2×PCR MasterMix 含上样液和示踪染料，故不需要额外加Loading Buffer。示踪染料的泳动速度相当于50bp的DNA片段。
9.在剩下的20μL预扩增反应液中加入980μL自备超纯水，相当于稀释50倍，所得50倍PCR模板稀释液将直接作为模板用于下步扩增或放-20℃保存待用。
四、选择性PCR扩增
10.制备引物：在本试剂盒提供的8只+3型EcoRI引物干粉和8只+3型MseI引物干粉中，每管分别加入1100μL自备超纯水，震荡混匀得16管引物母液。每管取66μL引物母液与1034μL超纯水在1.5mL离心管中混合得1100μL每个引物的相应工作液，共16管引物工作液。
11.在0.2 mL PCR管中，加入下列成分（第一次PCR时需要测试所有8×8=64种引物组合，需设置64个PCR反应。若已知哪个一种或几种引物组合适合，则可以直接使用选中的引物），下面以一种+3型EcoR I引物和+3型Mse I引物组合为例：

成分                                                                 体积
50倍PCR模板稀释液                                        5 μL
AFLP+3型EcoR I引物工作液（八种之一）       5 μL
AFLP+3型Mse I引物工作液（八种之一）         5 μL
2×PCR MasterMix                                            15 μL
12.轻柔混匀后离心数秒，按下列参数进行PCR：
                    温度            时间
PCR
13次循环     94℃            30秒
                    65℃            30秒（每次循环递减0.7℃）
                    72℃            60秒
PCR
23次循环    94℃             30秒
                    55℃            30秒
                    72℃             60秒
延伸    72℃    5分钟
四、尿素-PAGE电泳和银染（需另购试剂并按相关手册进行）
13.PCR结束后进行尿素-PAGE电泳和银染分析，本试剂盒不含相关试剂。

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