CAT#:JW-960906-50
低温运输,-20℃保存

逆转录试剂盒(cDNA合成试剂盒)

产品及特点
本试剂盒提供合成cDNA第一链（逆转录）所需要的全部试剂。其原理是用突变的莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶（M-MuLV RT）以RNA为模板，高效合成cDNA。它具有下列特点：
1.使用突变的反转录酶，内源RNase H活性低，使得在逆转录过程中RNA模板不容易被降解，得到的cDNA平均长度更长。
2.最长可合成13 Kb的cDNA。
3.可以使用oligo-dT、随机引物和RNA专一性引物三种引物（前两种本试剂盒提供）。
4.总RNA、poly(A)+RNA或特殊RNA均可作为模板。
5.得到的cDNA可用于后续的cDNA文库构建、RT-PCR、探针标记等。
6.本产品足够50次20uL体系的逆转录反应。
7.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品使用五孔盒包装
成份                                               编号          规格       包装
MMLV（含RI）                            960906a    50 uL        0.5mL红盖管
4×RT Buffer（含dNTP）            960906b     250 uL    0.5mL绿盖管
Oligo (dT)12-18引物干粉            220629       25ug       0.5mL白盖管
随机引物(6碱基，无修饰)干粉    220574       10ug       0.5mL黄盖管
 超纯水                                       210806       1 mL        1.5mL蓝盖管
使用手册                                    960906sc    1份               无

注意：首次使用本产品时，需要在Oligo (dT)12-18引物干粉管中加入50uL 超纯水，涡旋震荡半分钟混匀，得到0.5ug/uL的Oligo (dT)12-18引物溶液；需要在随机引物 (6碱基，无修饰) 干粉管中加入50uL 超纯水，涡旋震荡半分钟混匀，得到0.2ug/uL的随机引物溶液。没有用完的引物需要放置在-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法
一：合成PCR用的1st-strand cDNA
1.在一干净的反应管中加入RNA模板。注意：RNA模板不能含有基因组DNA污染。                    
RNA模板种类            加入量
总RNA                    100-500 ng
或poly(A) mRNA     10-500 ng
或专一的RNA          0.01 pg-500 ng
2.加入引物和水
引物种类                                    加入量
Oligo (dT)12-18，0.5 ug/uL        1 uL
或随机引物(6碱基，无修饰)，
0.2 ug/uL                                    1 uL
或RNA模板专一性引物               15-20 pmol
注意：随机引物与RNA模板的比例跟cDNA合成的平均长度成反比。
3.加水到13 uL 。
4.70℃保温5分钟后立即冰浴，此步可以打开RNA的二级结构。
5.再加入5 uL 4×RT Buffer（含dNTP）。
6.37℃保温5分钟。对富含二级结构的高GC RNA 模板，可以改成45℃保温5分钟。但如果使用随机引物，由于其很短，则改成25℃ 5分钟以便其跟RNA结合。
7.加入1 uL MMLV逆转录酶（含RI），反应终体积为20 uL。
8.42℃保温60分钟。但如果使用随机引物，需要先25℃保温10分钟，待合成了一段cDNA后，然后再转移到42℃保温60分钟。此步为RT反应。
9.70℃保温10分钟以终止反应，然后放置在冰上待用。合成的cDNA可以直接作为PCR模板使用，不需要纯化。
二：合成建文库用的1st-strand cDNA
1.在一干净的反应管中加入RNA模板。注意：RNA模板不能含有基因组DNA污染。                    
RNA模板种类            加入量
poly(A) mRNA               1ug
或专一的RNA            0.5-1 ug
2.加入引物
引物种类                                   加入量
Oligo (dT)12-18，0.5 ug/uL        1 uL
或随机引物(6碱基，无修饰)
0.2 ug/uL                                   1 uL
或RNA模板专一性引物              100 pmol
注意：随机引物与RNA模板的比例跟cDNA合成的平均长度成反比。
3.加水到13uL。
4.70℃保温5分钟后立即冰浴，此步可以打开RNA的二级结构。
5.再加入5 uL 4×RT Buffer（含dNTP）。
6.37℃保温5分钟。对富含二级结构的高GC RNA 模板，可以改成45℃保温5分钟。如果使用随机引物，则改成25℃ 5分钟。
7.加入2 uL MMLV逆转录酶（含RI），反应终体积为20uL。
8.42℃保温60分钟，但如果使用随机引物，需要先25℃保温10分钟，然后再转移到42℃保温60分钟。此步为RT反应。
9.70℃保温10分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的cDNA可以用于第二链cDNA的合成或放置在-20℃长期保存。

关联产品
两管式RT-PCR试剂盒