CAT#:JW-931178-10
低温运输，-20℃保存

DNA Shuffling试剂盒

产品及特点
DNA Shuffling即DNA分子的体外同源重组，它是一种分子水平上的定向进化(directed evolution)技术。DNA Shuffling以一个或多个基因为起始材料，通过先随机将这些基因断裂成DNA短片段，再进行互为模板和引物的PCR（无外加引物），最后再进行常规PCR（外加引物）等处理，最后得到含有大量DNA重组突变的PCR产物。DNA Shuffling原理示意图如下：

本产品就是根据上述原理优化改进而成，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板，无需单独准备各成分。
2.可以用于对长度在1000bp左右的同源片段进行DNA shuffling。
3.操作手册经过优化，只产生DNA Shuffling，而将点突变的几率减低到最低，节省大量优化时间。
4.本产品足够10次DNA Shuffling反应。
5.本产品只适用于科研，不能用于临床。

规格及成分
本产品使用10孔盒包装
成分                                                                   编号            规格        包装材料
DNase I溶液（1U/μL）                                   931178a      10 μL      0.5mL红盖管
DNA Shuffling专用反应液A，10×                   931178b1     100 μL    0.5mL绿盖管
DNA Shuffling专用反应液B，10×                   931178b2    100 μL     0.5mL紫盖管
2×DNA Shuffling专用无引物PCR MasterMix     931178c    1 mL        1.5mL白盖管
2×DNA Shuffling专用带引物PCR MasterMix    931178d    1 mL        1.5mL黄色管
超纯水                                                                210806     1 mL       2.0mL蓝盖管
使用手册                                                            131178sc    1份            无

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限一年。

自备试剂
待突变基因片段、DNA Shuffling引物（第二轮PCR引物）、胶回收试剂盒。

使用方法
1.提前开启37℃和90℃水浴或金属浴。
一：待突变基因片段的制备
2.待突变基因片段可以用来源于多个物种的、含同源基因片段的DNA。这些基因片段可以来于PCR制备，也可以来于限制性内切酶酶切法制备。
3.这些含同源基因片段（或同源基因片段的一部分）的DNA片段总长度不要超过1kb，同时比DNA shuffling终产物（第二轮PCR产物）长200-400 bp，因为第二轮PCR的引物位置在此步制备的模板DNA内侧100-200bp。
4.每次DNA Shuffling实验需要2-5 μg起始DNA片段。如果使用几个同源基因片段，则其比例为1:1:1，总量保证有2-5 μg。
5.起始模板DNA必须通过胶回收纯化，以便彻底去除残留的质粒模板、引物和非特异扩增产物等。如果不去除此步的引物，其将对后续PCR造成严重干扰。
6.测OD260确定模板DNA浓度，此溶液为同源基因DNA模板，放冰上待用。

二：酶切和回收模板DNA
7.准备10 μL DNase I工作液（0.1U/uL）。将1 μL本试剂盒提供的1U/uL的DNase I溶液和8uL超纯水、1 μL DNA Shuffling专用反应液A混合得浓度为0.1U/uL 的DNase工作液，放冰上待用。此溶液必须现配现用。
8.在一个PCR管中，按顺序加入下列成分：
成分                                                        用量
同源DNA片段（来于多个不同基因）    2-5 μg
DNA Shuffling专用反应液A，10×         10 μL
DNA Shuffling专用反应液B，10×         10 μL
DNase I工作液（0.1U/uL）                   2 μL
补超纯水到                                            100 μL
9.充分轻柔吹打混匀后37℃保温，分别在2分钟、4分钟、6分钟和8分钟取样，每次取25μL到一个新的PCR管中，马上放75℃以灭活DNase I。
10.在2-3%琼脂糖凝胶或10% PAGE胶上电泳上步所得的4个样品（每个25μL），根据DNA 电泳Marker锁定的分子量范围，回收25-150 bp范围的DNA并将其溶解在超纯水中，测260nm得浓度，放冰上待用。

三：无引物PCR
11.在一干净PCR管中加入0.5 μg回收片段、50 μL DNA Shuffling专用无引物PCR MasterMix、补加超纯水到100 μL。反应总体积为100μL。按下面的PCR反应参数进行第一轮无引物PCR：PCR前变性94℃150秒，PCR循环40次（94℃ 30s，47.5℃ 45s，72℃ 10 s，每次循环后增加5s），最后72℃ 10 分钟。
12.PCR结束后，取5-10 μL PCR产物进行电泳检测，然后对预期长度区域的PCR产物进行回收（如果同源区域长度为800bp，则回收600-1000bp范围的片段）。此步将去除小片段DNA对下轮PCR的干扰。
13.预留25%回收产物原液，剩余的75%分三份，每份25%。分别用超纯水将其分别稀释10倍、20倍和50倍。
四：带引物PCR
14.分别用上步的原液、10倍稀释液、20倍稀释液和50倍稀释液各1uL作为PCR模板，按下表设置4管带引物PCR反应：
成分          1号管           2号管       3号管       4号管
原液           1μL            
10倍稀释液                    1μL        
20倍稀释液                                    1μL    
50倍稀释液                                                  1μL
自备F和R引物
均10pmol/μL    各3 μL    各3 μL    各3 μL    各3 μL
加超纯水        到100 μL    到100 μL    到100 μL    到100 μL
2×DNA Shuffling专用带引物PCR MasterMix     50 μL    50 μL    50 μL    50 μL
15.按下面的PCR反应参数进行第一轮无引物PCR：PCR前变性94℃150秒，PCR循环25次（94℃ 30s，47.5℃ 45s，72℃ 60 s，每次循环后增加5s），最后72℃ 10 分钟。
16.电泳检测4个PCR产物，回收预期大小的PCR产物（根据引物位置估计预期大小），用于后续克隆和分析实验（略）。

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