CAT#:JW-971201
常温运输和保存

动物RNA纯化试剂盒（过柱法）

产品及特点
本产品用于从各种动物组织（包括白细胞）快速提取总RNA。它具有下列特点：
1.操作简单快速，整个过程只需要不到十分钟（对一个样品而言）。
2.RNA纯度更高，OD260/OD280一般在2.0左右。
3.一般不含用RT-PCR可以检测到的基因组DNA污染。
4.适用于培养细胞、大部分动物组织和部分植物组织。
5.得到的RNA可直接用于RT-PCR、Northern杂交、cDNA合成等实验。
6.性价比高于进口的柱式RNA提取产品。
7.可以进行无氯仿操作，只是纯度稍微降低，但不影响使用。
8.本产品足够50次微量柱式提取，每次可以处理100 mg左右的组织。
9.本产品只能用于科研。

规格及成分
成份                                编号       规格       包装
动物RNA纯化溶液A    971201a    50 mL    60 mL棕色瓶
动物RNA纯化溶液B    971201b    25 mL    30 mL本色瓶
离心吸附柱                 211207       50套        塑料袋
通用洗柱液                 220143       50 mL    60 mL本色瓶
RNA洗脱液                 971207       10 mL    10 mL本色瓶
使用手册                     971201sc    1份            1份
本产品使用大纸盒包装

运输及保存
常温运输和保存，溶液A 需要放4℃长期保存，有效期一年。

自备物品
氯仿，台式离心机

使用方法
下面的操作步骤是针对在1.5 mL塑料离心管中进行的微量提取的，如果处理样品量大，请按比例增加各成份的用量并使用大的离心管和离心机。
1.根据组织细胞类型的不同分为下面及种情况使用：
a)对贴壁细胞：吸尽培养液，在每10平方厘米细胞中加入1 mL动物RNA纯化溶液A，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解并且让基因组DNA充分断裂。
b)对悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，在每1-5×106悬浮细胞中加入1 mL动物RNA纯化溶液A，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解并且让基因组DNA充分断裂。如果是fibroblasts或carcinoma cell，1 mL溶液A的细胞使用量不要超过1E6个细胞。
c)对新鲜组织：先将剪切成小块新鲜组织或液氮保存的组织放入10 mL或15 mL塑料离心管中，每50-100 mg组织加1 mL动物RNA纯化溶液A，用Polytron剪切式匀浆器匀浆30秒左右。对肝、脾、胰、肾等细胞分裂十分旺盛的组织（细胞中含大量正在复制的DNA），建议组织的使用量不要超过50 mg/ mL动物RNA纯化溶液A，否则十分容易产生DNA污染。也可以用液氮研磨：在研钵中加入液氮，再加入50-100 mg新鲜组织，然后研磨成粉后转移到1.5 mL离心管中，再加入1 mL动物RNA纯化溶液A，震荡30秒混匀。
d)对非冻型组织RNA保存液或RNAlater等保存液保存的组织：先用纸吸去保存液后再剪切成小块，其余操作同新鲜组织的处理。
2.如果进行无氯仿操作（所得RNA纯度稍低，但一般不影响后续使用），则将上步所得的细胞裂解物或匀浆液转移至一个干净的1.5 mL塑料离心管中，12,000 rpm室温离心3-5分钟。
3.如果进行带氯仿操作（所得RNA纯度比免氯仿操作稍高），则将上步所得的细胞裂解物或匀浆液转移至一个干净的1.5 mL塑料离心管中，然后加入0.2倍体积的自备氯仿(1 mL动物RNA纯化溶液A需0.2 mL氯仿)，振荡器上充分振荡混均30秒，12,000 rpm室温离心3-5分钟。
4.将上清液转移到一个干净的2 mL塑料离心管中。注意：无氯仿操作时，离心后管底是细胞碎片和结缔组织纤维。带氯仿操作时，离心后分上下层，下层有机相和上下层中间含有DNA和蛋白质，吸取上清时避免触及，否则将产生蛋白质和DNA污染。为保险起见，可以留下100 μL上清液不取。同时吸取上清时最好缓慢进行。
5.加入等体积的动物RNA纯化溶液B，充分颠倒混匀。
6.分次（一般需要2-3次）将加入动物RNA纯化溶液B后的混合液转移到离心吸附柱中，12,000 rpm室温离心半分钟，弃穿透液。如果溶液粘稠，可以延长离心时间到2分钟。
7.加0.7 mL通用洗柱液到离心吸附柱中，12,000 rpm室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。一次洗涤一般足够去除杂质。
8.再加0.3 mL通用洗柱液到离心吸附柱中，12,000 rpm室温离心半分钟，弃穿透液。此步可以省略。
9.再室温12,000 rmp干甩半分钟。此步十分重要，否则残留的通用洗柱液会影响RNA的使用。
10.将离心吸附柱转移到一自备的RNase-free 1.5 mL塑料离心管中，加入50-100 μL RNA洗脱液。
11.室温12,000 rmp离心半分钟，离心管中溶液即为RNA样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。
12.RNA的电泳检测：本试剂盒提取的RNA最好用甲醛变性胶电泳，如果在非变性的普通琼脂糖胶（in TAE或TBE buffer）上电泳，一定要使用RNA专用上样液，千万不要使用常用的DNA上样液，因为DNA上样液没有经过去RNase处理，也不能将RNA变性，得到的带型将十分杂乱。
13.RNA完整性的电泳检测：如果需要做Northern杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA电泳，因为非变性胶不能分离所有的RNA分子（BioTechniques，28：414，2000）。
14.RNA产量产率测定：将5-10 μL RNA溶于TE缓冲液中(pH 7.5-8.2之间)检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出RNA浓度（1 OD260的RNA=40 μg/mL），进而计算出RNA的产量（浓度X体积)和产率(RNA产量/组织用量)。
15.RNA纯度测定：无污染的总RNA的OD260/OD280一般在1.8-2.1之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质污染，但一般不影响RT-PCR等反应。

疑难解答
Q：上样孔里的红色荧光物一定是DNA污染吗？
A：不是。用TAE或TBE电泳液和非变性胶电泳RNA时容易产生此现象，本公司初步研究发现大部分红色荧光物是变性不充分的单链RNA通过碱基互补或通过硼酸络合（如果使用TBE作电泳液的话）形成的复合物，加RNase处理后，这些红色荧光物(RNA)一般会消失。为避免此现象，建议最好使用甲醛变性胶电泳和RNA专用上样液。
Q：如何确认和去处除污染的基因组DNA？
A：如果怀疑有DNA污染，可以用RNase处理RNA样品，然后再电泳。如果上样孔里的红色荧光物不消失，则表示是基因组DNA污染。进一步确认可以使用PCR扩增法。去除污染的DNA可以使用本公司的RNase-free DNase。

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