CAT#:JW-931042-25
低温运输，-20℃保存

miRNA 染料法qRT-PCR试剂盒（polyA加尾法）

产品及特点
本试剂盒采用E.coli polyA聚合酶对miRNA加尾，然后用特异引物进行逆转录，最后用荧光定量PCR试剂盒进行定量检测，其原理示意图如下：

本产品具有下列特点：
1.两步法（加尾-逆转录、染料法qPCR），一步完成加尾-逆转录，然后检测多个miRNA靶分子。一次加尾-逆转录反应得到的cDNA可以做上百次PCR。
2.直接用总RNA为模板，不需要专门纯化miRNA，简单快捷。
3.检测灵敏度可以达到几百个拷贝/反应。
4.能区分有2-3个碱基不同的miRNA。
5.既可以定性，也可以定量。定量时线性范围至少有5个数量级，但需要自备标准品。
6.既可以用总RNA为模板，也可以用总miRNA为模板。
7.用户需要自备miRNA专一性的一条PCR上游引物。
8.本产品足够25次20uL体系的加尾和逆转录反应，100次20uL体系的染料法qPCR。
9.本产品只能用于科研。

规格及成分
成分                                                                       编号        规格    包装材料
加尾和逆转录Mix（含dNTP和ATP）                931042a    150 μL    0.5mL绿盖管
miRNA-polyA RT引物                                       931042b    干粉        0.5mL本色管
E.coli polyA聚合酶和M-MLV逆转录酶混合液    931042c    40 μL    0.5mL红盖管
miRNA PCR通用下游引物                                931042d    干粉        0.5mL黄色管
2×SYBR PCR MasterMix                                  990408      1 mL    0.5mL棕色管
超纯水                                                               980403      1 mL    2.0mL蓝盖管
使用手册                                                           931042sc    1份       无
本产品使用十孔盒包装
注意：上表的两个引物用前需要加入30uL的超纯水充分溶解混匀后才可使用。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂
总RNA、miRNA专一性上游引物（5pmol/μL in水中）

使用方法
一、设计、合成和分析自备的miRNA专一性上游引物
1.本试剂盒需要用户自行设计一条miRNA靶分子专一性的上游引物跟试剂盒提供的通用引物共同使用，用超纯水稀释到5pmol/μL待用。
2.miRNA专一性上游引物的Tm值决定后续PCR的复性温度，非常重要，故必须准确。可以通过网上的在线分析软件（如oligoanalyzer）计算Tm，但最好实验测定，做法是将100pmol miRNA专一性上游引物和等量的互补引物（不是下游引物）在20μL的本试剂盒提供的2×SYBR PCR MasterMix反应体系中混合（参考第9步，只是不加模板，其他成分都加），直接进行溶解曲线分析，测出在本试剂盒提供的反应体系中的Tm值。当软件计算的Tm值和实验测试的Tm值有差异时，以后者为准。
3.miRNA专一性上游引物最好在3端比miRNA短几个碱基。
4.可以选择一个所研究物种的5.8S rRNA作为内参，设计一条5.8S rRNA专一性的引物，同时做平行实验。

二、准备总RNA
5.用自选方法和试剂纯化总RNA，测定其浓度，最后用超纯水将其稀释到100ng/μL。总RNA样品中残留的DNA污染由于并没有下游通用引物（miRNA-polyA RT引物）的结合位点，所以一般不会干扰基于本方法的miRNA PCR检测。
三、加尾及逆转录反应
6.按下表设置RNA加尾和逆转录反应，以1个样品为例：
加入组分                                                          体积
自备的总RNA，100ng/μL                                2.0 μL
加尾和逆转录Buffer（含dNTP和ATP）            5.5 μL
miRNA-polyA RT引物                                       1.0 μL
E.coli polyA聚合酶和M-MLV逆转录酶混合液    1.5 μL
合计                                                                    10 μL
7.37℃保温1小时。
8.加入190μL超纯水使得总体积为200μL（稀释20倍），此样品将作为cDNA模板用于PCR。未用完的cDNA 20倍稀释样品可以放-20℃至少两年以上。
二、染料法qPCR
9.按下表设置染料法qPCR反应，最好每个反应设置3个重复：
加入组分                                                体积
2×SYBR PCR MasterMix                       10 μL
自备Forward Primer，5pmol/μL             1 μL
miRNA PCR通用下游引物，5pmol/μL    1 μL
第8步所得miRNA cDNA 20倍稀释液      1 μL
超纯水                7 μL
10.建议反应程序设置如下：
循环        温度                               时间
PCR
45次        95℃                             15秒
    （miRNA特异引物Tm-5）℃    15秒
                72℃                               20秒
溶解曲线分析    根据PCR仪要求设定
11.分析溶解曲线分析所得Tm（在70-80℃之间一般表示扩增是特异的），分析Ct值，分析标准曲线的斜率和R2（如果用阳性对照做了标准曲线反应的话）。

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