CAT#:JW-230713-100
低温运输，-20℃保存

染料法实时可调易错PCR试剂盒

产品及特点
   易错PCR（Error-Prone PCR）是利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′ 校对功能的特性，在一定条件下（如不同的dNTP浓度、Mg2+浓度和MnCl2存在）能够以较高的机率随机引入突变。如果有适当的选择方法，则可从构建的突变库中筛选出所需突变体。很多时候，用户需要通过易错PCR得到不同突变数的DNA片段。为满足此需求，本公司开发了可调易错PCR试剂盒。在实用过程中，发现易错PCR循环数很难优化，PCR循环数过多或过少都得不到清晰的DNA条带用于后续回收和克隆。本公司继续改进并推出染料法实时可调易错PCR试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，十分简单方便。
2.在荧光信号进入平台期即可终止循环，此时电泳就可以得到清晰的突变DNA条带，不需要盲目摸索，节约大量的时间。
3.实验人员在一定范围内可以控制突变率，一轮PCR的突变率范围在2-8个突变/1000 bp，更高的突变率可以通过多轮PCR达到。
4.可用于连续易错PCR，只需把上一次易错PCR的产物用作下一次易错PCR的模板即可，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。
5.可以扩增的DNA片段更长，达到2 kb，对于2 kb以上的产物，建议分段扩增。
6.本试剂盒足够100次30 mL体系的染料法实时易错PCR。
7.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品采用五孔盒包装
成份                                                                        编号             规格           包装
5×染料法实时可调易错PCR Mix（含dNTP）        230713a    600 mL    1.5 mL黄盖管
可调易错PCR专用Taq DNA聚合酶（5 U/mL）     211216b     50 mL      0.5 mL红盖管
可调易错PCR专用MnCl2                                        211216c    300 mL    0.5 mL紫盖管
可调易错PCR专用dGTP                                        211216d     300 mL    0.5 mL蓝盖管
10×可调易错PCR追加dNTP                                   211216e    300 mL    0.5 mL本色管
使用手册                                                                230713sc      1份       1份

运输及保存
低温运输，-20℃保存, 有效期为一年。

自备试剂
引物、DNA模板、常规PCR试剂盒。

使用方法
1.将引物稀释到10 μM。引物也是决定易错PCR成败的关键因素，设计引物时要保证其Tm在70℃，长度在25-30 nt之间，GC含量在45%-60%之间，3′ 端GC含量低，并且没有发夹结构。
2.用自备易错PCR引物和自备的常规PCR试剂扩增制备易错DNA模板（常规PCR产物），胶回收并准确确定浓度。注意：易错PCR的模板一定要用胶回收的常规PCR产物，因为胶回收会可以把电泳不可见的非特异性扩增片段去除，否则这些片段由于也是用易错PCR引物扩增所得，在易错PCR扩增时也会被扩增，产生竞争抑制，降低靶分子的扩增效率。
3.将回收的DNA片段（模板）稀释到100 ng/mL、10 ng/mL和1 ng/mL三个浓度。注意：模板使用量是影响突变率的最重要因素，模板DNA为非突变DNA，扩增产生的DNA为突变DNA，易错PCR体系最终DNA产量是基本固定的，因此模板DNA使用量越大，则突变DNA在终产物中的相对比例就越低，突变率就越低。故建议同时测试三个模板用量。如果都成功，则优先选用模板浓度低的PCR产物进行分析。
4.根据每1000 bp的预期突变数按下表确定30 mL易错PCR体系中MnCl2和dGTP的用量（这是在模板DNA不超过1 ng的前提下的数据）。表中的Mn表示可调易错PCR专用的MnCl2, dG表示可调易错PCR专用的dGTP：
预期突变数         2个    3个    4个    5个    6个    7个    8个
Mn用量（mL）    0     1.0     2.5     4.0     4.0    4.0     4.0
dG用量（mL）    0       0         0     1.0     2.0    3.0     4.0
5.设置30 mL体系的可调易错PCR：第一次建议设置3个模板浓度。在3个干净的PCR管中，分别加入下列成分。最后加可调易错PCR专用MnCl2：
成分                                                       模板用量1                   模板用量2                      模板用量3
5×染料法实时可调易错PCR Mix               6 mL                            6 mL                            6 mL
可调易错PCR专用dGTP            根据上步用量表表选择     根据上步用量表选择        根据上步用量表选择
自备DNA模板                                  1 mL（100 ng/mL）        1 mL（10 ng/mL）       1 mL（1 ng/mL）
自备PCR引物(10 mM each)                   1 mL each                    mL each                        1 mL each
可调易错PCR专用Taq DNA聚合酶               0.5 mL                    0.5 mL                            0.5 mL
可调易错PCR专用MnCl2        根据上步用量表表选择     根据上步用量表表选择        根据上步用量表表选择
自备超纯水                                            补水到30 mL                   补水到30 mL               补水到30 mL
6.按已经优化的常规PCR条件进行染料法实时易错PCR：
PCR前变性                            94℃ 3分钟
易错PCR
(60次循环，但操作时PCR应该在荧光信号进入平台期后结束，不一定要做满60个循环)    94℃ 1分钟
                                            60℃ 1分钟
                                           72℃ 3-10分钟。在此步采集SYBR通道的荧光
注：由于易错PCR含高浓度的Mg2+，因此容易形成引物二聚体，因此需要使用60℃这种较高的复性温度，以避免小片段扩增产物竞争性抑制PCR。易错PCR一般不需要热启动，也不需要在易错PCR结束后做延伸处理。易错PCR循环次数越多，突变DNA（扩增产物）与非突变DNA（原始模板）的比例就越高。此外在突变率和模板长度恒定的情况下，扩增次数越多，发生突变的绝对数就越高，在同一模板上发生的突变位点数就越多。但循环数过多或过少都不容易在电泳时形成清晰的DNA条带，没有条带就没法回收克隆。所以需要在荧光信号进入平台期后立即停止PCR。
7.染料法实时易错PCR结束后，取3 mL电泳检查。
8.如果有预期大小的PCR产物，则用剩余的PCR产物进行胶回收，再进行克隆和测序等后续操作。
9.如果需要提高突变率，可以选择上轮易错PCR产物为模板，再进行下一轮易错PCR。
10.如果第一轮易错PCR没有得到预期大小的PCR产物或者扩增60次也没有荧光信号，可以按下列操作进行一轮追加PCR。
11.在PCR管中，加入3 mL 10×可调易错PCR专用追加dNTP到27 mL电泳剩下的第一轮易错PCR体系中（用了3 mL去电泳），按下表进行追加PCR（chasing PCR）。注意追加PCR只做20次循环。
步骤                       参数                   循环数
追加PCR        94℃ 1分钟        循环20次，但实际操作时，只要荧光信号进入平台期即可在72℃结束时终止PCR。
                       60℃ 1分钟    
                        72℃ 1分钟，在此步采集SYBR通道的荧光    
12.追加PCR结束后，再电泳检测。如果有条带，再进行克隆和测序等后续操作。如果需要增加突变率，可以此轮追加PCR的产物为模板，再进行下一轮易错PCR。
13.如果没有预期大小的PCR产物，则需要分析原因。

关联产品
易错PCR试剂盒