CAT#:JW-230712
低温运输，-20℃保存

染料法实时易错PCR试剂盒

产品及特点
易错PCR（Error-Prone PCR）是利用天然Taq DNA聚合酶不具有3′→5′校对功能的特性，在一定条件下（如不同的dNTP浓度、Mg2+浓度和MnCl2存在）能够按较高的机率随机引入突变而设计。如果有适当的突变选择方法，则可从构建的突变库选出所需突变体，用于人工诱变。但是易错PCR在操作中最大的问题是最佳PCR循环数的摸索，循环次数太多或太少，都得不到成形的突变DNA条带，影响后续的DNA回收和克隆步骤。为克服此缺点，本公司开发了染料法实时易错PCR产品，它具有下列特点：
1.即开即用，十分简单方便。
2.可以实时监控PCR的进程，用户可以不需要任何摸索就能在最佳时间（荧光信号刚进入平台期）停止PCR，立即进行电泳，回收到突变DNA。
3.配方经过精心优化，突变率稳定，在0.66%左右（±0.13%）。主要引入点突变，一般不会引入插入或缺失突变。
4.比体内基因突变更快捷简单，但如果在PCR引物中设计位点，则可使产物克隆到表达载体，也可以用于体内蛋白活性的筛选。
5.可用于连续易错PCR（sequential error-prone PCR），只需把上一次易错PCR的产物用作下一次易错PCR的模板即可，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。
6.只适用于扩增1 kb以下的产物，对于1 kb以上的产物，建议分段扩增。
7.本产品足够100次30 mL体系的染料法实时易错PCR反应。
8.本产品只能用于科研。

规格及成分
成份                                                            编号           规格        包装
10×染料法实时易错PCR Mix（含酶）    230712a    300 mL    0.5 mL红色盖
易错PCR专用dNTP                                220167b    300 mL    0.5 mL黄色盖
易错PCR增强剂                                      220167c    300 mL    0.5 mL白色盖
追加dNTP，0.5 mM                                220167d    300 mL    0.5 mL本色管
易错PCR专用MnCl2                                220167e    300 mL    0.5 mL绿色盖
使用手册                                                    220167sc    1份        1份
本产品使用五孔盒包装

运输及保存
低温运输，-20℃保存, 有效期为一年。

自备试剂
引物、DNA模板、超纯水。

使用方法
1.将自备的PCR引物稀释到10 mM。引物是决定易错PCR成败的关键因素，设计引物时要保证其Tm在70℃，长度在25-30 nt之间，GC含量在45%-60%之间，3端GC含量低，并且没有发夹结构。
2.用自备引物和自备的常规PCR试剂扩增制备易错DNA模板（常规PCR产物），胶回收并准确确定浓度。注意：易错PCR的模板一定要用胶回收的常规PCR产物，因为胶回收可以把电泳不可见的非特异性扩增片段去除，否则这些片段由于也是用易错PCR引物扩增所得，在易错PCR扩增时也会被扩增，产生竞争抑制，降低靶分子的扩增效率。如果常规PCR制备模板的引物和易错PCR引物不同（类似巢式PCR）则可以避免此问题，但需要合成两对引物。本试剂盒只适用于扩增1 kb以下的产物，对于1 kb以上的产物，建议分段扩增。
3.将回收的DNA片段（模板）用水稀释到1 ng/mL 、10 ng/mL和100 ng/mL三个浓度。注意：模板使用量是影响突变率的最重要因素，因为模板DNA为非突变DNA，扩增产生的DNA为突变DNA，易错PCR体系跟常规PCR一样，最后会达到扩增平台，最终得到的扩增DNA的量是固定的，因此起始模板DNA使用量越大，则突变DNA在最终得到的总DNA中的相对比例就越低。但模板太少又不容易扩增成功，所以建议同时测试三个模板用量。如果都成功，则优先选用模板浓度低的PCR产物进行分析。
4.设置30 μL体系的易错PCR反应。在干净的PCR管中，分别加入下列成分。由于Mn离子容易跟其他成分发生沉淀反应，因此上机前最后加MnCl2：
成分                                                        管1                   管2                            管3
10×染料法实时易错PCR Mix（含酶）    3 mL               3 mL                            3 mL
自备DNA模板                               1 mL（1 ng/ mL）    1 mL（10ng/ mL）    1 mL（100 ng/ mL）
自备易错PCR引物(10 mM each)        各1 mL                各1 mL                        各1 mL
易错PCR增强剂                                      3 mL               3 mL                                3 mL
易错PCR专用dNTP                                3 mL                3 mL                                3 mL
易错PCR专用MnCl2                               3 mL                3 mL                                3 mL
补自备超纯水    加到30 mL    加到30 mL    加到30 mL
5.立即按下列参数进行易错PCR：
步骤                        参数               循环数
PCR前变性        94℃ 3 min        循环1次
染料法实时
易错PCR            94℃ 1 min       循环60次，在72℃时采集Sybr Green I通道的荧光信号
                           60℃ 1 min    
                        72℃ 3-10 min    
注：由于易错PCR含高浓度的镁离子，因此引物容易互为模板形成引物二聚体，因此使用60℃为复性温度。在错误碱基掺入后，DNA合成会暂时停滞，因此为了让DNA合成继续，需要延长合成的时间到3-10分钟。易错PCR循环次数越多，突变DNA（扩增产物）与非突变DNA（原始模板）的比例就越高。此外在突变率和模板长度恒定的情况下，扩增次数越多，发生突变的绝对数就越高，在同一模板上发生的突变位点数就越多。但循环次数过多，又得不到完成的DNA条带，没法进行后续的克隆。所以可以设置60次循环并不表示要完成60次，而是需要在荧光信号不再增长，进入平台期后立即停止易错PCR并进行电泳回收。
6.易错PCR结束后，立即电泳检测。如果扩增产物长度正确，则进行胶回收，再进行克隆和测序等后续操作。如果需要增加突变率，可以选择一个突变后的DNA为模板，再进行下一轮易错PCR。
7.如果没有扩增，则按下列操作进行追加PCR。
8.在易错PCR管中，加入3 mL追加dNTP到27 mL剩下的染料法实时易错PCR体系中，按下表进行追加实时PCR（chasing Real-Time PCR）。
步骤                       参数                循环数
追加实时PCR    94℃ 1 min    循环20次，在72℃时采集SYBR Green I通道的荧光信号
                          60℃ 1 min    
                          72℃ 1 min    
9.追加实时PCR荧光信号进入平台期后立即结束PCR，并不需要等到20个循环结束，并进行电泳检测。如果有DNA条带并且长队正确，则再进行克隆和测序等后续操作。如果需要增加突变率，可以选择一个突变后的DNA为模板，再进行下一轮易错PCR。
10.如果没有预期大小的PCR产物，则需要分析原因。

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