CAT#:JW-230823
常温运输和保存

细胞核细胞浆细胞器RNA纯化试剂盒

产品及特点
真核细胞的RNA存在于三个部位，第一个部位是细胞核，主要是刚转录出来的各种RNA前体。第二个部位是细胞浆，主要是用做翻译模板的成熟mRNA、rRNA、tRNA和miRNA等。第三个部位是线粒体和叶绿体这些细胞器，它们有自己独立的RNA。在某些研究中，需要分部位纯化RNA。本产品就是专门满足此类需求的试剂盒。它具有下列特点：
1.采用专用膜裂解液，依次分离细胞浆、细胞器裂解液和细胞核三个组分，分别用于提取对应的RNA。
2.起始材料为培养的哺乳动物细胞，如HEK293、HeLa和HT1080，但不适用于实体组织和有细胞壁的真菌细胞和植物细胞。
3.基于异硫氰酸胍的沉淀法提取，RNA回收率高，基因组DNA污染少。
4.得到的RNA可直接用于RT-PCR、Northern杂交、cDNA合成等实验
5.性价比高于进口的柱式RNA提取产品。
6.本产品足够50次细胞浆RNA纯化、50次细胞器RNA纯化和50次细胞核RNA纯化。一次提取需要10E6-10E7个哺乳动物培养细胞。
7.本产品只能用于科研。

规格及成分
成份                            编号          规格           包装
细胞膜专用裂解液    230823a     20 mL     30 mL本色瓶
细胞器专用裂解液    230823b     20 mL     30 mL本色瓶
动物RNA提取液        220148a    250 mL    250 mL棕玻瓶
CI混合液                    220163     50 mL      50 mL棕玻瓶
核酸沉淀剂B型        230908       150 mL    250 mL本色瓶
RNA洗脱液              971207      10 mL      10 mL本色瓶
使用手册                230823sc      1份                无
本产品使用大纸盒包装

运输及保存
常温运输和保存，动物RNA提取液需要放4℃长期保存，有效期一年。

自备试剂
PBS、胰酶溶液（0.25%胰酶、0.9mM EDTA）、75%乙醇

使用方法
一、细胞的准备（本试剂盒不含本步相关试剂）
1.在直径10cm的培养皿（面积为55平方厘米）中培养贴壁细胞到80%融合度，去掉培养基，用常温自备PBS洗涤贴壁细胞。
2.加入0.8mL胰酶溶液处理（0.25%胰酶、0.9mM EDTA）37℃保温直到细胞分散（至少2分钟）。
3.加入5mL含10%胎牛血清的培养基终止胰酶消化，然后将细胞转移到离心管中。
4.4℃ 500×g离心10分钟，小心去上清液。
5.加入0.5mL预冷PBS重悬细胞并转移到1.5mL RNase-free离心管中。
6.4℃ 500×g离心10分钟，小心去上清液。

二、细胞浆裂解样本的准备
7.在细胞沉淀中加入400 mL预冷的细胞膜专用裂解液。
8.在4℃冷室的脱色摇床上端对端摇晃10分钟以确保细胞膜完全裂解。
9.4℃ 2000×g离心10分钟。
10.小心将上清液均分到两个1.5mL RNase-free离心管中，分别加入1mL动物RNA提取液，涡旋震荡30秒，标记为细胞浆RNA，室温放置待用（跟后面的细胞器裂解样本和细胞核裂解样本一起纯化）。

三、细胞器裂解样本的准备
11.在上步的沉淀（含细胞核和细胞器）中加入400 mL预冷的细胞器膜专用裂解液。
12.在4℃或冰上放置30分钟以确保细胞器膜完全裂解。
13.4℃ 7000×g离心10分钟。
14.小心将上清液（细胞器裂解液）均分到两个1.5mL RNase-free离心管中，分别加入1mL动物RNA提取液，涡旋震荡30秒，标记为细胞器RNA，室温放置待用（跟后面的细胞核裂解样本一起纯化）。

四、细胞核裂解样本的准备
15.在上步的沉淀（含细胞核）中加入1mL动物RNA提取液，涡旋震荡30秒，室温放置10分钟。离心管标记为细胞核RNA。
16.跟上面的两个样本共5管一起进入下一步操作。

五、RNA纯化
17.在装有裂解物-动物RNA提取液混合物的5个离心管中分别加入0.2mL CI混合液，振荡器上充分振荡混均30秒。注意：一定要把官底的溶液震荡起来，否则只是液面的振动。
18.14000 g室温离心3分钟。
19.将上清液（约0.6 mL）转移到另一干净的1.5 mL塑料离心管中。下层有机相（蓝色）和中间层含有DNA和蛋白质，避免触及，否则将产生蛋白质和DNA污染。为保险起见，可以留下50-100 mL上清液不取。
20.在上清液中加入等体积的核酸沉淀液B型，振荡器上振荡30秒混匀。
21.14000 g室温离心5分钟，离心底的侧面将形成RNA沉淀。
22.小心吸弃上清液，注意不要吸弃RNA沉淀。
23.在含RNA沉淀的离心管中加入1mL自备的75%乙醇，振荡混匀30秒。
24.14000 g室温离心3分钟。
25.小心吸弃上清液，注意不要吸弃RNA沉淀。
26.短暂快速离心，用移液枪小心吸弃残留乙醇(约50 mL)。注意不要吸弃RNA沉淀。此步十分重要，否则残留的乙醇会影响RNA的后续使用。
27.室温放1-2分钟后立即加入50-100mL RNA洗脱液使RNA沉淀溶解。千万不要用真空离心法使RNA沉淀过于干燥，否则RNA将变得十分难溶。RNA样品可以立即用于电泳、OD测定、RTR-PCR或存放于-80℃待用。

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