CAT#:JW-240118
常温运输和保存，有低温成分

一站式蛋白质非变性PAGE电泳试剂盒（低pH）

产品及特点
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native PAGE）是目前电泳法分离活性蛋白的主要方法之一，与SDS-PAGE根据分子量大小分离蛋白质不同，它主要根据蛋白质的pI分离蛋白质。由于蛋白质的pI各不相同，所以对不同靶蛋白质需要选用具有不同pH的电泳体系。单独配制不同pH的Native PAGE电泳胶十分繁琐，为此本公司开发了本产品。它有下列特点:
1.即开即用，用户不需单独准备各种成分，十分方便。
2.非变性，电泳过程中蛋白质保持天然的构象和亚基之间的相互作用，得到的蛋白质一般都具有生物活性（而SDS-PAGE得到的蛋白没有活性）。
3.可以用于分析蛋白质和DNA或RNA的相互作用、蛋白修饰、蛋白构型改变、回收有活性蛋白质等试验。
4.电泳后可直接用于考染、银染、Western杂交等实验。
5.本产品足够30次mini PAGE电泳。
6.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品使用大扁盒包装
成份                                                编号                  规格            包装
丙烯酰胺干粉                               100864                60 g           250 mL棕塑瓶
甲叉双丙烯酰胺干粉                    100877                3 g             5 mL本色瓶
TEMED                                        CAS:110-18-9     1.5 mL      1.5 mL棕色管
过硫酸铵干粉                               CAS:7727-54-0    1 g            1.5 mL白色盖
4×低pH浓缩胶配胶液，pH 6.7    240118a                100 mL    125 mL本色瓶
4×低pH分离胶配胶液，pH 4.3    240118b               200 mL      250 mL本色瓶
低pH电泳液，pH 4.5（干粉）    240118c                32 g            60 mL本色瓶
5×低pH上样液                            240118d                1 mL           1.5 mL本色盖
使用手册                                     240118sc               1份            1份

运输及保存
常温运输和保存，5×低pH上样液需低温运输、-20℃ 保存，保存期为一年。

自备试剂
去离子水、天然PAGE蛋白质标准或蛋白质等电电泳标准品

使用方法
一：配制分离胶
1.确定浓度。对分子量在100 kD以上的蛋白质，可选用3-5%的胶；对分子量在20-150 kD之间的蛋白质，可选用5-10%的胶；对分子量在10-80 kD之间的蛋白质，可选用10-15%的胶。对未知样品，建议使用7.5%的胶。
2.配制10%的APS（过硫酸铵）：按每0.1 g过硫酸铵干粉加1 mL去离子水的比例配制10%的APS溶液，该溶液可以在4℃存放一周。
3.配制30%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺（19：1）溶液:在本产品提供的装有60 g丙烯酰胺干粉的塑料瓶中加入146 mL自备的去离子水和3 g甲叉双丙烯酰胺，充分摇晃直到溶解（约需10-20分钟）即得200 mL 30%丙烯酰胺（19：1）溶液。此溶液最好在一个月内用完，必须4℃避光保存。
4.配10 mL分离胶(如果配制其他体积，请按比例调节各成分用量)：在一个25 mL的三角瓶中，先加入4.2 mL去离子水、3.3 mL 30%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺（19：1）溶液和2.5 mL 4×分离胶配胶液。
5.摇晃混匀后抽真空10-15分钟以去除溶液中的氧气（氧气能抑制丙烯酰胺聚合反应，不去除的话将影响丙烯酰胺聚合反应，聚合所花时间延长）。
6.加入50 μL新配制的10% APS和10 μL TEMED（这是配制10 mL胶的用量，配制更大体积的胶则按比例增加），迅速摇匀后倒胶。注意：由于在低pH缓冲液中PAGE聚合速度降低，所以需要加倍上述两成分的用量。上述量已经加倍。
7.在胶面距离顶部1-1.5 cm的时候停止灌胶。然后覆盖一层1-5 mm厚的水，使胶顶部液面平整。由于比重不同，水和丙烯酰胺溶液不会混合。
8.室温聚合30-60分钟后，用1×分离胶配胶液洗涤凝固的胶的顶部，待用。

二：配制浓缩胶（浓缩胶可以提高分辨率，适合于成分复杂的样品，一般使用浓度为4%。使用浓缩胶时蛋白质泳动速度主要跟其尺寸和形状相关。因浓缩胶pH跟分离胶pH不同，蛋白质可能会发生聚合和沉淀。对成分单一的样品，可以不用浓缩胶，此时蛋白的泳动速度主要跟其电荷密度，尺寸和形状相关。
9.配10 mL浓缩胶(如果配制其他体积,请按比例调节各成分用量): 在一个25 mL的三角瓶中，先加入6.2 mL去离子水、1.3 mL 30%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺（19：1）溶液和2.5 mL 4×浓缩配胶液。
10.摇晃混匀后抽真空10-15分钟以去除溶液中的氧气（氧气能抑制丙烯酰胺聚合反应，不去除的话将影响丙烯酰胺聚合反应，聚合所花时间延长）。
11.按上表用量加入50 μL 10% APS和15 μL TEMED（这是配制10 mL胶的用量，配制更大体积的胶则用量需按比例增加），迅速摇匀后在已经凝固的分离胶上倒胶。
12.在液面达到顶部时停止灌胶，插入梳子。
13.室温聚合30-60分钟，拔出梳子，用1×电泳液冲洗加样孔。

三：电泳
14.将凝胶板固定在电泳装置上，往上槽和下槽加入足够1×电泳液。注：本产品提供可配10 L电泳液的干粉，用前需将所有干粉溶于不超过900 mL水中，用约80 mL冰乙酸调pH值至4.5，然后定容至1 L，得10×电泳液，可以室温放置，用时再稀释成1×电泳液。稀释后一般不需要再调节pH，但保险起见，可以用pH试纸测试一下1×电泳液。低pH电泳缓冲液的pH是4.5。
15.连接电极。如果浓缩胶和分离胶的pH高于靶蛋白pI，靶蛋白将带负电荷并向阳极移动，可以按标准的SDS-PAGE方法接通电极（上阴极下阳极）；如果浓缩胶和分离胶pH低于靶蛋白pI，靶蛋白将带正电荷并向阴级移动，此时应该下阴极上阳极。
16.300 V预电泳直到电流不再降低（约需要30分钟）以去除残留过硫酸铵。
17.换电泳液。
18.在液体蛋白质样品中加入5×上样液（16 μL液体样品加4 μL上样液）后上样。0.75 mm厚的胶可以上10 μL，1.5 mm厚的胶可以上20 μL。在未用加样孔中也要加1×上样液以防有样品的空道的样品扩散。注意：如果用考染检测，每个孔的蛋白最好在50-100 μg总蛋白，如果银染则只需要1 μg即可。样品如果是蛋白质沉淀，可用1×上样液直接溶解蛋白质沉淀后再上样。蛋白质溶液或沉淀中不能含有能够改变上样液pH的残留成分（如蛋白质沉淀剂TCA），用前最好用pH试纸测试一下，不在上样液的pH范围时就用酸或碱调到正常范围。大量样品可用透析法调pH。
19.上样自备的天然PAGE蛋白质标准或等电电泳的标准品（如果有的话）。
20.用15 mA（对0.75 mm厚的胶）或30 mM（对1.5 mm厚的胶）的电流电泳直到染料移动到分离胶底部。微型胶一般需要1-2小时。注意：电泳过程最好在冷室或有冷却系统，以免电泳产热使蛋白质变性。
21.终止电泳，取出凝胶进行后续的实验处理（如染色或酶活性检测）。

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