CAT#:JW-231010
低温运输，-20℃保存

小鼠端粒长度检测试剂盒（染料法qPCR相对定量）

产品及特点
端粒是指真核细胞染色体末端独特的蛋白质-DNA结构，小鼠端粒由TTAGGG重复串联构成，长度约为30～50Kb。端粒对于染色体的稳定非常重要，其主要通过防止染色体降解及端端融合来维护染色体的稳定和功能。因为线形染色体的末端复制问题，细胞每次分裂，端粒逐渐减少，直到达到关键长度，此时细胞步入老化阶段。因此，外周血白细胞的端粒长度与年龄呈负相关，快速检测端粒长度具有重要的意义。本试剂盒根据染料法荧光定量PCR原理，在同一反应中同时检测端粒和一个单拷贝基因，根据两个扩增产生的荧光信号的比值来确定小鼠端粒的相对长度，其原理示意图如下：

它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供小鼠外周血DNA模板。
2.操作只需要半天，比Southern杂交检测法快3-5天时间。
3.使用PCR扩增，几乎每个分子生物学实验都有相关设备，非常方便。
4.准确检测各种起始量的模板，扩增稳定、定量结果具有高度重复性。
5.本产品足够50次20 μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
6.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品采用十孔盒包装
成分                                                    编号        规格           包装
2×SYBR qPCR MasterMix            231010a        1 mL      1 mL本色盖
RNase-free ddH2O                       231010b        1 mL       1.5 mL蓝盖管
50×ROX（可选）                          231010c        250 μL    1.5 mL棕色管
小鼠端粒引物（10 μM）              yw231010        50 μL     0.5 mL棕色管
小鼠单拷贝内参引物（10 μM）    ryw231010       50 μL    0.5 mL棕色管
使用手册                                        15-231010sc    1份          无

运输及保存
低温运输，-20℃避光保存，保存期限为一年。

自备试剂
样品DNA。

使用方法
一、SYBR qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
1.强烈建议每个样本做3次重复（定量实验至少需要3个生物学重复），按下表加入各成分：
成分                                        样品管     内参管
2×SYBR qPCR MasterMix     各10 μL     各10 μL
小鼠端粒引物（10 μM）          0.4 μL      -
小鼠端粒内参引物（10 μM）    -             0.4 μL
待测DNA样本（0.5-5ng/μL）    各1 μL    各1 μL
50×ROX（可选）                      0.4 μL    0.4 μL
补超纯水到                                   20 μL    20 μL
注意：可根据选择的仪器在反应体系中加入ROX染料，将反应体系中的荧光信号标准化。下表为所列使用不同仪器操作时所需的ROX量（每50 μL反应体系）：
仪器                                                                  每50 μL反应所需ROX量
ABI7300、7900HT、StepOne                                         5 μL
ABI7500、7500Fast、ViiA7、Stratagne Mx3000TM、
Mx3005PTM以及Mx4000TM    1 μL
Roche仪器、Bio-Rad仪器、Eppendorf仪器                无需添加
2.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
过程                      温度    时间
预变性                 95℃    1分钟
PCR反应
（35-40个循环）    95℃    10秒
                               55℃    30秒
                               72℃    45秒，采集（SYBR通道的荧光信号）
熔解曲线分析
四、数据分析
3.熔解曲线分析：熔解曲线分析用于判断扩增是否有效。如果得到Tm分别为81℃（端粒PCR产物）和80℃（内参PCR产物）的两个峰，则表示实验有效，可以进入下一步分析。如果没有同时得到这两个峰，则表示扩增为非特异性扩增，实验无效，不需要分析Ct数据，需要找到原因后再继续实验。
4.计算相对端粒长度：使用的2^-ΔΔCt法（Livak法）进行计算，得到T/S的比值作为端粒的相对长度。
对于端粒，ΔCq（端粒）是两个基因组DNA样本之间端粒的定量Cq值之差：ΔCq（端粒）= Cq（端粒，样本2）- Cq（端粒，样本1）；
注意：ΔCq（端粒）的值可以是正数，0或负数。
对于单拷贝内参，ΔCq（单拷贝内参）是两个基因组DNA样品之间单拷贝内参的定量Cq值之差：ΔCq（单拷贝内参）= Cq（单拷贝内参，样本2）- Cq（单拷贝内参，样本1）；
注意：ΔCq（单拷贝内参）的值可以是正数，0或负数。
ΔΔCq = ΔCq（端粒）- ΔCq（单拷贝内参）。
样本2/样本1的相对端粒长度（倍数）= 2^-ΔΔCq。
 
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