CAT#:JW-230102-5
低温运输，-20℃保存

PCR法DNA探针标记试剂盒（不含标记底物）

产品及特点
PCR 标记的原理是用带标记的dNTP进行PCR，最后得到的PCR产物将带有标记，可以直接用于杂交试验。本产品就是基于上述原理的基础上开发，它具有下列特点：
1.一站式，本试剂盒提供经过优化的试剂，不需要用户自己摸索。
2.一次标记可以得到µg级的双链DNA探针或约700ng的单链DNA探针，足够多次杂交实验用。
3.既可用于制备双链探针，也可以用于单链探针。
4.A型需自备含标记核苷酸的dNTP，B和C型分别含生物素和地高辛标记的底物。可用的自备标记底物包括fluorescein-dUTP、hydroxycoµmarin-dUTP、resorµfin-dUTP和aminoallyl-dUTP等。
5.掺入率一般为4-5%，有效降低了空间阻碍，检测效果最佳。
6.标记探针可以用于Southern和Northern Blot、原位杂交、菌落和斑点印迹杂交等分析。
7.足够10次50 µL体系的常规PCR（用于制备标记反应的模板和设置对照反应）和5次50 µL体系的标记反应。
8.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品使用5孔盒包装
名称                                    编号                规格    包装
标记专用 PCR Mix(含酶)    210701a        500 µL    0.5 mL红盖管
dATP，10 mM each        11-220859        50 µL    0.5 mL白盖管
dTTP，10 mM each        11-220862        50 µL    0.5 mL绿盖管
dGTP，10 mM each        11-220860        50 µL    0.5 mL黄盖管
dCTP，10 mM each        11-220861        50 µL    0.5 mL本色盖管
使用手册                           230102sc            1份    无

运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂
DNA模板和模板专一性引物，常规PCR Mix。

使用方法
一：准备工作
1.按常规的方法设计PCR引物，使PCR产物（探针）长度在400-800bp之间。过短则地高辛标记掺入少，探针杂交信号强度减弱；过长则非特异杂交增加，背景变强。
2.为保证成功率，最好先用常规PCR产物制备DNA片段，再以之为模板进行标记PCR反应。不推荐以基因组DNA或其他背景复杂的DNA为模直接进行PCR标记反应。
3.四种10mM的dNTP是分开提供，用于制备50µL非标记dNTP（2mM each，用于非标记PCR，用于制备标记PCR的模板。配制方法是四种10mM的dNTP各加10µL，再加水10µL即可）和25µL标记dNTP（2mM each，其中标记核苷酸和对应的非标记核苷酸的比例需要自行优化，假如是biotin或DIG标记的是dUTP，则其对应的非标记核苷酸是dTTP，两者的最佳比例一般为1：3；如果是BrdUTP，则两者的最佳比例为1：1。配制方法是三种10mM的dNTP各加5µL，再加标记核苷酸和其对应的标记核苷酸使其总的终浓度为2mM，再补水到25µL即可）。

二：非标记PCR产物的制备
1.设置50µL非标记PCR：2×标记专用PCR Mix 25 µL，dNTP Mix（2mM each）5µL，自备的探针引物（10pmol/µL）各1µL，1 µg基因组DNA或1ng质粒DNA，补超纯水到50µL。
2.按已经优化的PCR参数进行常规PCR。
3.胶回PCR产物并定量，胶回收可以避免残留引物干扰后续的标记PCR。

三：标记PCR反应
注意：由于双链PCR探针在杂交时变性的双链彼此还会复性，降低杂交效率，因此强烈推荐使用单链标记PCR。
成份                                                                      样品              非标记对照
2×标记专用PCR Mix                                             25 µL                25 µL
含标记核苷酸的dNTP Mix（自备）                       5 µL                 不加
dNTP Mix，2mM                                                    不加                5 µL
若单链标记：加探针引物其一                               50 pmol            50 pmol
若双链标记：加探针引物一和引物二                   各 50 pmol        各 50 pmol
胶纯化所得PCR产物（单链标记可用100ng模板）    10 ng           10 ng
超纯水                                                                    补到50 µL        补到50 µL
1.按第5步的PCR参数进行标记PCR，但需要进行下列修改：一是循环数增加到35-55个循环。由于模板为纯化后的PCR产物，探针对扩增长度完整性要求不高（长度不均的探针由于能形成网络结构，效果反而更好），所以可以增加循环数；二是延伸时间增加15秒，因为标记dµTP参入到DNA的速度比常规的dTTP慢；三是降低复性温度5-7℃，因为标记核苷酸参入到DNA后，新模板的Tm值将降低。
2.标记探针的定量：取标记反应液和对照反应液1-5 µL，在琼脂糖凝胶上跟浓度已知的DNA Marker一起电泳，并判断探针的浓度。由于标记产物中额外带有生物素，地高辛等、其泳动速度将慢于非标记PCR产物（但同位素标记不能用此法）。下图是一个典型的双链PCR产物电泳结果图：

标记的DNA（右）与未标记的DNA（左）电泳比较

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