CAT#:JW-230222
常温运输和保存，有三个低温成分

包埋法eccDNA纯化及扩增试剂盒

产品及特点
eccDNA就是extrachromosomal circular DNA（染色体外环状DNA）的简称，它们是从正常基因组中分离或脱落下来，游离于染色体基因组之外的环状DNA，含量非常低，长度主要分布在0.1-5kb之间，99%小于25kb。近年来研究表明，eccDNA往往在肿瘤和衰老过程中富集，以特殊的方式参与肿瘤和衰老的发生发展进程。在大部分人类癌症细胞中eccDNA广泛存在，且它的富集通常会促进癌基因的扩增，从而增加了癌基因的可塑性和不稳定性，因此其对肿瘤细胞的进化可能存在重要的意义。但是纯化eccDNA，尤其是纯化测序级的eccDNA一直是个难题，为此本公司精心开发出了包埋法eccDNA纯化技术，它具有下列特点：
9.即开即用，起始材料最好为贴壁或悬浮培养细胞、实体组织、白细胞。如果是实体组织或冷冻组织，效果稍差。
10.采用包埋法纯化，极大程度抑制了细胞核DNA的污染。
11.采用沉淀法纯化，避免采用磁珠和过柱纯化，防止了短eccDNA的丢失。
12.采用酶切去除人线粒体DNA，降低其对eccDNA分析的干扰。
13.采用荧光染料法滚环扩增RCA试剂盒，进一步富集eccDNA。
14.使用非生物源性的核酸助沉剂，避免了外源核酸对RCA和测序的干扰。
15.足够25次eccDNA纯化和扩增实验，一次纯化可以处理2E7个细胞。
16.本产品只能用于科研。
规格及成分
本产品第一部分，编号230222pt1，大扁盒包装，常温运输和保存
名称                                                          编号     规格         包装
包埋法eccDNA纯化溶液A                   230222a    75mL     60mL本色瓶
包埋法eccDNA纯化溶液B                   230222b    5mL       5mL本色瓶
包埋液                                                 230222c    25mL     30mL本色瓶
去蛋白溶液A                                        230222f    17.5mL    30mL棕玻瓶
去蛋白溶液B                                        230222g    7.5mL    10mL棕玻瓶
微量核酸沉淀剂V2.0（无生物源性）    221231    35mL      60mL本色瓶
使用手册                                              230222sc    1份           无
本产品第二部分，编号230222pt2，十孔盒包装，低温运输，-20℃保存
名称                                            编号           规格            包装
蛋白酶K溶液，10mg/mL         220137        500mL       0.5mL黄盖管
超纯水                                     210806        1mL            0.5mL蓝盖管
10×人mtDNA内切酶缓冲液     230222h        0.5mL       0.5mL绿盖管
人mtDNA内切酶                      230222i         25mL        0.5mL红盖管
RCA专用随机引物干粉            220225          25次         0.5mL白盖管
Phi29 DNA聚合酶，10U/mL    11-221198a    13mL       0.5mL红色管
10×Phi29 DNA聚合酶缓冲液    11-221198b    25mL     0.5mL绿色管
dNTP-染料混合液                     221080a        37.5mL    0.5mL白盖管
使用手册                                   230222sc        1份                无

运输及保存
第一部分需要常温运输和保存，第二部分需低温运输和-20℃保存，有效期一年。

自备试剂
自备PBS、琼脂糖，75%乙醇

使用方法
整个过程所需溶液和设备（Dounce玻璃匀浆器）均需提前半小时将其放冰上预冷，下面的步骤所述溶液均是预冷液。
一、培养细胞的预处理
38.用自备PBS洗涤生长中的培养细胞3次。
39.用无菌的塑料刮片将细胞收集至一个小体积PBS内，用细胞计数器计算细胞数，再加入适量包埋法eccDNA纯化溶液A（以下简称溶液A）使细胞终浓度为2E7个细胞/mL。
二、新鲜组织样品的预处理
40.在干净的容器内（如培养皿），用干净刀片将新鲜组织切割成芝麻大小的小粒(1~2mm³)，放入装有PBS的Dounce玻璃匀浆器中匀浆。此步将使得细胞脱落，但也有很多细胞被机械裂解。
41.经两层纱布过滤除去结缔组织块。
42.用PBS洗悬浮涤细胞3次，用少量溶液A重悬细胞，用细胞计数器计算细胞数，再加入适量溶液A使细胞终浓度为2E7个细胞/mL。
三、冰冻组织样品
43.用-70℃预冷的研钵将冰冻组织研成粉末，然后混悬在PBS中。
44.经两层纱布过滤除去结缔组织连块。
45.用PBS洗涤悬浮细胞三次，用少量溶液A重悬细胞，用细胞计数器计算细胞数，再加入适量溶液A使细胞终浓度为2E7个细胞/mL。
四、血液白细胞样品的制备
46.用自选方法从全血中粗分出白细胞。
47.再用自备的红细胞裂解液将白细胞层中残留的红细胞裂解。
48.将白细胞重悬在PBS中，细胞终浓度为2E7个细胞/mL。
五、包埋块及包埋提取液的制备
49.在配制琼脂糖电泳胶所用的制胶托盘上，按常规方法以超纯水为缓冲液灌制2%琼脂糖凝胶，厚度为0.5cm左右，待其凝固后，用刀片将还在制胶托盘中的琼脂糖凝胶切出10个0.5cm×0.5cm大小的孔，挑出其中的胶块。将这个制胶托盘和上面的带10个小孔的凝胶放42℃金属浴上待用。
50.用水浴加热试剂盒提供的包埋液，80℃水浴融化后摇匀，取1mL到一新的离心管中，放42℃金属浴孔中待用。
51.将1mL细胞悬液（2E7个细胞/mL）加热到42℃。
52.在琼脂糖胶上掏空的每个孔中分别加入0.1mL包埋液，然后加入0.1mL细胞悬液，用枪头轻柔搅动让细胞和包埋液充分混匀。重复此操作，直到10个孔中都装满包埋液和细胞悬液的混合液。
53.将制胶托盘（包括托盘里的凝胶）在4℃放30分钟，10个孔中的包埋液-细胞混合液将凝结成包埋块。
54.用刀片切掉包埋块周边的琼脂糖凝胶，小心将10个包埋块分别转移到1个5-10mL的塑料离心管中。
55.分别加入2mL新鲜制备的包埋块eccDNA提取液（制备2mL裂解液的方法： 溶液A 2mL，溶液B 200mL，蛋白酶K溶液 20mL，混匀后即可）。
56.用脱色摇床在50℃轻柔摇晃12小时后用移液枪小心收集包埋块外的eccDNA提取液，共约2mL，平均分到4个1.5mL塑料管中，命名为eccDNA初提液。
六、eccDNA初提液去蛋白
57.由于eccDNA初提液中有高浓度的蛋白酶，因此需予以去除，否则会严重干扰后续实验。故在4管初提液中，分别加入0.5mL去蛋白溶液A，再涡旋震荡2分钟。
58.再加入0.2mL去蛋白溶液B，再涡旋震荡2分钟。
59.常温13000g离心 5分钟，溶液将呈两层相。将含有DNA的上层转移到一个新的离心管中。
60.在上清中加入1mL的微量核酸沉淀剂（取用前需要颠倒混匀后取用），颠倒混匀，常温15000g离心15分钟，小心弃上清后加入1mL自备75%乙醇，颠倒10次，常温15000g离心3分钟，小心弃上清后短暂离心30秒。去掉残留的液体（约50mL）。
61.敞开盖子3分钟后，各加入50mL超纯水，吹打重悬，汇集在一起得eccDNA再提液200mL，用NanoDrop或PicoGreen法DNA定量试剂盒测试eccDN再提液浓度。取20mL做eccDN再提液留样作为后续实验的对照。
七：线粒体DNA酶切
注意：本步只限人线粒体DNA。如果用生物信息学的手段排除线粒体DNA对测序数据的干扰，可以跳过此步。材料不是人细胞的也可以跳过此步。
62.在一个PCR管中设置如下反应：
成分                                     加入量
10×人mtDNA酶切缓冲液      20mL
eccDNA再提液                     180mL
人mtDNA内切酶                    1mL
63.37℃保温4小时。
64.加入0.2mL去蛋白溶液A，再涡旋震荡2分钟。
65.再加入0.1mL去蛋白溶液B，再涡旋震荡2分钟。
66.常温15000g离心 5分钟，溶液将呈两层相。将含有DNA的上层转移到一个新的离心管中。
67.在上清中加入0.4mL的微量核酸沉淀剂（取用前需要颠倒混匀后取用），颠倒混匀，常温15000g离心15分钟，小心弃上清后加入1mL自备75%乙醇，颠倒10次，常温15000g离心3分钟，小心弃上清后短暂离心30秒。去掉残留的液体后，开盖放置3分钟。
68.加入20mL超纯水，吹打溶解沉淀，得到去蛋白后的eccDNA精提液。用NanoDrop或PicoGreen法测试所得eccDNA的浓度。
九：去除人线粒体DNA效果检测
69.可以用自备的线粒体PCR试剂盒，以eccDNA再提液留样和eccDNA精提液为模板进行扩增，检测去除线粒体DNA的效果。本试剂盒不含人线粒体DNA检测试剂盒，用户需要另外购买。本步也可以跳过。
九：RCA扩增
70.按下表设置RCA反应，注意：一定要设置一个阴性对照NC。首次使用本产品时，需要在RCA专用随机引物干粉管中加入25mL超纯水，涡旋震荡溶解引物，再短暂离心10秒。没有用完的引物需要放置在-20℃保存。
成分                                        样本管      NC管
eccDNA精提液                        5.5mL       -
超纯水                                       -            5.5mL
RCA专用随机引物溶液            1mL        1mL
dNTP-染料混合液                    1.5mL     1.5mL
10×phi29 DNA聚合酶缓冲液    1mL        1mL
合计                                        9.5mL       9.5mL
71.95℃ 5分钟变性DNA，立即放冰上。
72.分别加入0.5mL的phi29 DNA聚合酶。
73.30℃保温16小时。如果使用荧光定量PCR仪保温，则设置每10分钟一个循环，每次循环采集一次SYBR通道的荧光信号。样本管应该有标准的扩增曲线，而阴性对照管将没有扩增曲线。如果阴性对照有扩增，则在出峰时需要停机，已经出峰的样本管的扩增产物可以使用。
74.70℃10分钟变性灭活酶，所得扩增后的DNA可以用于各种后续实验。

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