CAT#:JW-230323
常温运输和保存，有三个低温成分

酵母eccDNA纯化及扩增试剂盒

产品及特点
eccDNA就是extrachromosomal circular DNA（染色体外环状DNA）的简称，它们是从正常基因组中分离或脱落下来，游离于染色体基因组之外的环状DNA。长度主要分布在0.1-5Kb之间，99%小于25Kb。近年来研究表明，eccDNA普遍存在于包括酵母在内得真核细胞中，因此其进行深入研究具有重要的意义。但是纯化eccDNA，尤其是测序级的eccDNA一直是个难题，为此本公司开发了本产品，它具有下列特点：
1.即开即用，直接用培养的酵母细胞为起始材料，最后得到纯化的eccDNA，用户不需要自己配制各种溶液，优化各种条件。
2.基于沉淀法，不用过柱法和磁珠法，减少短的eccDNA的丢失。
3.含专门的酶切消化线状DNA的步骤，降低线状DNA的干扰。
4.本产品含荧光染料法滚环扩增试剂盒，进一步富集eccDNA。
5.本产品一次可以处理约5×10E8个培养的酵母细胞。
6.本产品足够25次eccDNA的纯化和扩增实验。
7.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品使用大扁盒包装，有三个低温成分
名称                                    编号        规格                包装
酵母eccDNA纯化溶液A    230223a    250mL       250mL本色瓶
酵母eccDNA纯化溶液B    230223b    250mL       250mL本色瓶
酵母eccDNA纯化溶液C    230223c    250mL        250mL本色瓶
酵母eccDNA纯化溶液D    230223d    250mL       250mL棕色玻璃瓶
酵母eccDNA纯化溶液E    230223e    250mL×2    250mL本色瓶
酸洗玻璃珠（直径800um）    220310    10g       10mL本色瓶
线状DNA消化缓冲液        230223f        1.5mL    1.5mL绿盖管
线状DNA消化酶                    230223g    15uL    0.5mL红盖管
环状DNA RCA试剂盒        221080    25次/1套    五孔盒
使用手册                        230223sc        1份        无

运输及保存
常温运输和保存，但三个低温成分：线状DNA消化缓冲液、线状DNA消化酶和环状DNA RCA试剂盒需要低温运输和-20℃保存，有效期一年。

自备试剂
75%乙醇，超纯水

使用方法
一：eccDNA粗提（粗体液中含有线状DNA，线粒体DNA和eccDNA）
1.培养酵母细胞：按常规方法离心沉淀5×10E6个酵母细胞。
2.加入10mL 酵母eccDNA提取溶液A后重悬细胞，加入玻璃珠（800nm）0.1g，涡旋震荡3分钟。
3.加入10mL 酵母eccDNA提取溶液B，轻柔颠倒10次。
4.加入10mL 酵母eccDNA提取溶液C，轻柔颠倒10次。
5.常温离心7500g 10分钟，此步将沉淀下大部分染色体DNA和蛋白质。
6.将上清液体转移到新的10mL离心管中。
7.加入等体积的酵母eccDNA提取溶液D，涡旋震荡3分钟。
8.常温离心7500g 5分钟，蛋白质将在两相中间形成白膜。小心将含DNA的上清转移到新的离心管中。
9.重复第11-12步一次。
10.常温离心7500g 5分钟，残留蛋白质将在两相中间形成白膜。小心将含DNA的上清转移到新的离心管中。
11.加入2倍体积的酵母eccDNA提取溶液E，颠倒混匀后，常温离心7500g 10分钟。
12.加入自备的10mL 75%乙醇，颠倒混匀后，常温离心7500g 3分钟。
13.吸弃上清后，再短暂离心，再吸弃上清。沉淀即含有酵母eccDNA的粗提物。
14.开盖短暂放置在室温3分钟。
15.加入50uL 1×线状DNA消化缓冲液，再加入1uL线状DNA消化酶，轻柔吹打混匀。
16.37C保温2小时。
17.加入酵母eccDNA提取溶液D，充分涡旋震荡混匀。
18.常温离心7500g 5分钟，将上清液转移到新的离心管中。
19.加入2倍体积的酵母eccDNA提取溶液E，颠倒混匀。
20.常温离心4500g 10分钟。
21.加入10mL 75%乙醇，颠倒混匀后，常温离心4500g 3分钟。
22.吸弃上清，短暂离心，再吸弃上清。
23.加入20uL超纯水，吹打溶解酵母eccDNA沉淀。由于有助沉剂，所以沉淀可见。
24.取5uL进行RCA扩增，剩余的放-20℃长期保存。
25.RCA扩增：在两个PCR管中，分别加入加入5uL eccDNA模板（样品管）和5uL超纯水（阴性对照管），再分别加10uL 2×RCA扩增液，2uL 20×随机引物V2.0，2uL超纯水，共19uL。 95℃ 5分钟变性，立即放冰上，再分别加入1uL的phi39 DNA聚合酶，30℃保温16小时。如果使用荧光定量PCR仪保温，则设置每10分钟一个循环，温度30℃，每次循环采集一次SYBR通道的荧光信号。样本管应该有标准的扩增曲线，而阴性对照管将没有扩增曲线。
26.70℃10分钟变性灭活酶，所得扩增后的DNA可以用于各种后续实验。

关联产品
饱和型LAMP荧光染料