CAT#:JW-230328-20
低温运输和保存

高效E.coli化学感受态细胞制备试剂盒

产品及特点
本试剂盒是基于Inoue方法的、高效快速E.coli化学感受态细胞制备试剂盒。本产品具有下列特点：
1.一步式操作，离心后重悬细胞即可，非常简单。
2.转化率高，转化效率一般都在10E8/ug质粒以上。
3.重复性好，可用于各种E.coli菌种，包括K12系（如JM109、DH5a等）和B系（如BL21系列菌种）。
4.适用于低、中、高拷贝的各种质粒。
5.本试剂盒足够20次制备，每次可以制备可以用50 mL菌液制备80管感受态细胞。所得感受态细胞在-80℃至少可以保存半年以上。
6.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品使用大扁盒包装
名称                                                    编号        规格                包装
E.coli化学感受态细胞制备溶液A    230328a    250 mL×2    250mL本色瓶
E.coli化学感受态细胞制备溶液B    230328b    6 mL            10mL本色瓶
使用手册                                       230328sc    1 份               无

运输及保存
低温运输，4℃保存（开封后请-20℃保存，防止污染），有效期一年。

自备试剂
无菌超纯水，SOB和SOC液体培养基，相关抗菌素，温控摇床。

使用方法
1.划盘，过夜培养出单菌落。
2.次日下午，接种一个单个直径为2-3毫米的菌落到1 mL不含抗生素的SOB液体培养基中，37℃ 220rpm摇晃过夜培养。
3.次日早上，将20 uL上步得到的菌液接种到2 mL SOB液体培养基中，37℃ 250-300 rpm摇晃培养3小时。此时菌液将轻微浑浊。
4.将1 mL上步得到的菌液接种到50 mL SOB液体培养基中（用250 mL三角瓶），用户也可以分别接种1 mL，0.5 mL和0.25 mL到3个 50 mL的SOB液体培养基中，这样2-3小时测OD时总有一瓶OD会在0.3-0.4，避免了多次测OD可能带来的污染。
5.室温或18℃ 250-300 rpm摇晃培养2-3小时，直到OD600在0.3-0.4之间。注意：确保室温或18℃培养非常重要，在此温度下细菌OD600达到0.3-0.4所需时间跟菌种不同而不同。
6.将菌液放置在冰上10分钟。同时预冷下步要用的50 mL无菌离心管和20 mL溶液A。所需冷冻离心机也最好开启制冷。
7.将50 mL菌液转移到2个预冷的无菌离心管中，每管25mL。在冷冻离心机上4ºC 3000g离心10分钟，弃上清。注意：必须低温离心，否则转化效率将减低100倍。
8.再在4ºC 3000g短暂离心半分钟，用移液枪小心吸出残留液体。注意：残留上清必须彻底去除，否则会影响感受态效率。
9.在沉淀中加入20 mL预冷的溶液A，轻弹离心管底轻柔重悬菌体。注意：不要涡旋振荡。
10.冰上放置5分钟。期间预冷4.3 mL新鲜配制的感受态活化液（4 mL 溶液A+0.3 mL 溶液B，充分混匀后放冰上）和装感受态细胞所需的无菌塑料离心管。
11.4ºC 3000g离心10分钟，弃上清。
12.在沉淀中加入4 mL第9步预冷的感受态活化液，重悬细菌后冰上放置10分钟。
13.按50 uL/管分装到预冷的无菌塑料离心管中。此时细胞将处于感受态，可以直接用于转化，也可立即放到-80℃保存。50 mL菌液一次可以制备80管感受态细胞。
二：转化步骤
1.将冻存的感受态细胞置于冰中解冻。
2.加入1-5 uL质粒（100pg-10ng）或1-5 uL连接反应液。用加DNA的移液器轻柔吹打混匀，不要涡旋震荡。
3.冰浴15-30分钟。期间可以37ºC预热1 mL自备的、不含抗菌素液体培养基（此处最好用SOB，因为LB培养基将降低转化率）。
4.42ºC热激60秒后冰浴1-2分钟。
5.加入1 mL 37ºC预热的不含抗菌素液体培养基后，37ºC保温1小时。如能160~225rpm振荡培养更佳。
6.将50-100 uL菌液涂布在含适当抗菌素的琼脂平板培养基上，37ºC过夜培养。

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