CAT#:JW-230316-50
常温运输及保存

凋亡DNA定量试剂盒（qLM-PCR法）

产品及特点
细胞凋亡显著特点之一是细胞染色体被一种内源性核酸内切酶降解，产生长度为180-200bp的整倍数的DNA片段，称之为凋亡DNA Ladder。由于只有凋亡细胞才产生凋亡DNA Ladder，因此检测凋亡DNA Ladder对筛选哪些药物或处理可以调控细胞凋亡具有重要的指导意义。但凋亡细胞一般只占总细胞的很少比例，故通过常规方法检测不是灵敏度低，就是步骤繁琐，为此本公司开发了基于Linker Mediated-PCR（LM-PCR）的凋亡DNA实时荧光定量试剂盒，它具有下列特点：
1.一站式，用户不需要单独优化实验条件。
2.用于实时定量检测总DNA中所含的凋亡DNA。
3.起始材料为总DNA，免去单独提取凋亡DNA步骤。同时比细胞材料保存更方便。
4.利用染料法荧光定量LM-PCR，整个过程只要两小时（不含DNA纯化）。
5.灵敏度比TUNEL/FACS、Annexin-V/FACS和caspase ELISA等常规方法更高，最低可以检测到pg级别的凋亡DNA（相当于不到100个凋亡细胞）。
6.可以进行定性分析，也可以进行绝对定量分析。
7.定量分析时可计算出平均每个细胞中有多少凋亡DNA，线性范围在3个数量级。
8.本产品可以根据客户需求升级为单细胞凋亡DNA检测。
9.本产品足够50次实验。
10.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品采用10孔盒包装
成份                                       编号                规格      包装
LM-PCR Linker干粉              220316a        50次     1.5 mL黄盖管
连接反应液（待加linker）    220316b        1 mL      1.5 mL绿盖管
LM-PCR通用引物干粉          220316c        50次      1.5 mL白盖管
荧光PCR专用模板稀释液     180701           1 mL      1.5 mL绿盖管
T4 DNA Ligase，350U/μL    11-T220758    50 μL    0.5mL红盖管
2×SYBR qPCR MasterMix    990408          0.5 mL    0.5 mL棕色管
超纯水                                   210806           1 mL       1.5mL蓝盖管
使用手册                                220316sc        1份            无
注意：首次使用时需要将连接反应液（待加linker）全部转移到LM-PCR Linker干粉管中，得到已加Linker的连接反应液。同时，需要加入55μL超纯水到LM-PCR通用引物干粉中，涡旋震荡混匀。一次实验没有用完的需要-20℃保存。

运输及保存
低温运输、-20℃保存、有效期一年。

自备试剂
细胞总DNA纯化试剂盒，凋亡DNA纯化试剂盒，细胞凋亡诱导试剂

使用方法
一、制备待测样品的总DNA
1.制备N个样品的总DNA（含基因组DNA和凋亡DNA），需要在纯化前准确进行细胞计数。所需起始细胞数量需参考所用DNA纯化试剂手册。得到DNA后需测OD260以确定其浓度和产量。一个人体细胞含有6.64pg DNA，可以通过预期总DNA产量和实际DNA产量计算出总DNA的产率。最后用自备的TE缓冲液将所有待测样品的总DNA浓度稀释到5ng/μL，放冰上待用。也可以分装成N个小份放-20℃保存。本试剂盒不含相关试剂。
二、制备凋亡DNA标准曲线样品（定性检测可以跳过此步）
2.用可以诱导细胞凋亡的条件处理已知数量的培养细胞，诱导细胞凋亡，然后纯化凋亡DNA，并电泳确认得到凋亡DNA Ladder，并且没有基因组DNA残留。一个人体细胞含有6.64pg DNA，可以通过预期总DNA产量和实际凋亡DNA产量计算出凋亡DNA的产率。将凋亡DNA的浓度用TE缓冲液调到25ng/μL，此溶液将作为PCR反应时的阳性对照。本试剂盒不含上述实验相关试剂。
三、制备凋亡DNA标准曲线样品的4倍梯度稀释液（定性检测可以跳过此步）
3.标记6个离心管，分别为1-6。
4.用带芯枪头（下同）分别加入30 μL 荧光PCR专用模板稀释液。
5.在1号管中加入10 μL 凋亡DNA阳性对照，充分震荡1分钟，得1号稀释液。
6.换枪头，在2号管中加入10 μL 1号稀释液，充分震荡1分钟，得2号稀释液。
7.重复上面的操作直到得到6个稀释液，全部放冰上待用。
四、Linker连接反应
8.如果做定性分析：标记N+2个PCR管，其中N个用于第一步得到的N个待测样品，1个用于阴性对照，1个用于阳性对照。如果做重复，则按比例增加样品的反应管数量。各成分加样量如下：
成分                                                样品管N个        阴性对照                阳性对照
连接反应液（含LM-PCR Linker）    各19 μL           19 μL                       各19 μL
N+2个待测样本（5ng/μL）               各20 μL           不加                        不加
第1步所得凋亡DNA标准曲线样品（25ng/μL）        不加        不加         4 μL
超纯水                                                不加               20 μL                       17 μL
T4 DNA连接酶                                    各1 μL           1 μL                        各1 μL
9.如果做定量分析：标记N+7个PCR管，其中N个用于待测样品，1个用于阴性对照，6个用于标准曲线。如果做重复，则按比例增加样品的反应管数量。各成分加样量如下：
成分                                                       样品管N个     阴性对照      6个标准曲线管   

连接反应液（含LM-PCR Linker）            各19 μL         19 μL         各19 μL
N+2个待测样本（5ng/μL）                      各20 μL         不加            不加
第7步所得6管
凋亡DNA稀释液                                       不加               不加            各20 μL
（1号到1号管……）
超纯水                                                      不加                20 μL        不加
T4 DNA连接酶,10U/μL                            各1 μL            1 μL            各1 μL
10.总体积为40μL体系，16℃过夜保温16小时。
11.加360μL超纯水，将连接产物稀释10倍。
四、PCR反应
12.在0.2 mL离心管中设置N+2个（对定性实验）或N+7个（对定量实验）PCR体系。在每管中分别加入的成分：
成分                                                                        体积
连接液产物的10倍稀释液（来于第12步）               9 μL
LM-PCR通用引物                                                     1 μL
试剂盒提供的SYBR PCR Mix                                  10 μL
13.离心数秒，按下列参数进行PCR扩增：预合成72℃ 4分钟（不是94℃变性），然后PCR循环40次（94℃1分钟，72℃43分钟，采集SYBR通道的荧光信号）。由于凋亡DNA片段长短不一，故不能设置溶解曲线分析。
五、数据分析
14.判断实验有效性：如果阴性对照出现阳性结果（有倒S型荧光信号，Ct在35以下），则整个实验结果无效。可能是污染或其他原因，需要找到原因后才能继续。如果阳性对照出现阴性结果，则整个实验结果也无效，需要找到原因后才能继续。如果阳性结果为阳性，阴性结果为阴性，则实验有效，可以继续分析。
15.如果是定性检测，只判断待测样本阳性或阴性。如果其Ct没有读数、大于或等于40则均判为阴性，如果小于40则为阳性。
16.如果是定量检测，则以标准曲线样本的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品凋亡DNA的浓度的log值，再推算出其浓度。再根据凋亡DNA的产率，推算出纯化出这些凋亡DNA需要多少细胞，最后得出每个细胞有多少凋亡DNA。

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