CAT#:JW-230367-10
常温运输和保存

cDNA第二链合成试剂盒

产品及特点
cDNA第二链合成试剂盒的起始材料是已经完成第一链cDNA合成的RNA-DNA杂交链。其原理是用RNase H使RNA-DNA杂合链中的RNA产生切口，再用DNA Polymerase I通过切口平移(nick translation)反应进行RNA链取代合成cDNA第二链，其示意图如下:

本产品具有下列特点：
1.即开即用，含有合成cDNA第二链的所有试剂，包括RNase H、 E.coli DNA聚合酶1和DNA连接酶。
2.一管式操作，不需要每次进行纯化，不丢失宝贵的样品。
3.所得双链cDNA可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR、cDNA文库构建、抑制性差减杂交等。
1.本试剂盒足够10次80uL体系的cDNA第二链合成反应。

规格及成分
本产品采用5孔盒包装
名称                                                编号         规格               包装
5×cDNA第二链合成缓冲液          230367a    160 μL    0.5mL白盖管
20×cDNA第二链合成酶混合液    230367b    40 μL      0.5mL黄盖管
0.2 M EDTA溶液                         130309       60 μL     0.5mL本色管
超纯水                                        100935       1 mL      1.5mL蓝盖管
使用手册                                    230367sc    1份        无

运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂
cDNA第一链合成试剂等

使用方法
一、合成cDNA第一条链
本试剂盒不提供cDNA第一链合成试剂，用户需自备相关试剂合成cDNA第一链。
二、合成cDNA第二链
1.在冰浴上向10uL已经完成cDNA第一条链合成的反应体系（逆转录体系）中依次加入下表试剂，如果多于10uL，请只取用10uL：
成分                                       用量
超纯水                                    48 μL
cDNA第二链合成缓冲液       16 μL
cDNA第二链合成酶混合液    4 μL
共80uL，轻柔吹打混匀后，短暂离心，16℃保温2小时
自备的T4 DNA聚合酶（见注）    1 μL
轻柔吹打混匀后，16℃继续保温30分钟
0.2M EDTA溶液                     2 μL
注：克隆双链cDNA一般需要平末端化，需要T4 DNA聚合酶处理步骤。PCR、SSH等后续处理一般不需要把双链cDNA平末端化，则可以跳过T4 DNA聚合酶处理步骤，直接用EDTA终止反应。
2.终止反应：如果后续实验(如电泳)不担心EDTA的影响，可以直接加入4 uL 0.2M EDTA溶液终止反应，然后将样品放-20℃长期保存。如果后续实验（如PCR扩增）不担心cDNA的单双链状态，可以95℃保温10分钟终止反应。如果后续实验既受EDTA影响，又不能是单链DNA，则可以用PCR过柱纯化法纯化。
3.电泳5 μL检测cDNA质量。如果cDNA在0.5-10Kb的范围内呈模糊一片，则cDNA合格。如果没看见cDNA或有其他异常，需查找原因后再继续。
4.所得cDNA可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR、cDNA文库构建、抑制性差减杂交（SSH）等实验。

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一管式双链cDNA合成试剂盒（起始材料为RNA）