CAT#:JW-230431
低温运输，-20℃保存

人端粒长度检测试剂盒（染料法qPCR法）

产品及特点
端粒是指真核细胞染色体末端独特的蛋白质-DNA结构, 人类端粒由 TTAGGG重复串联构成, 长度为 5～15Kb。端粒对于染色体的稳定非常重要, 其主要通过防止染色体降解及端端融合来维护染色体的稳定和功能。因为线形染色体的末端复制问题, 细胞每次分裂, 端粒可减少20～200bp, 直到达到关键长度, 此时细胞步入老化阶段。因此, 外周血白细胞的端粒长度与年龄呈负相关，快速检测端粒长度具有重要的意义。本试剂盒根据染料法荧光定量PCR原理，在同一反应中同时检测端粒和一个单拷贝基因，根据两个扩增产生的荧光信号的比值来确定端粒的相对长度，其原理示意图如下：

它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供外周血DNA模板。
2.操作只需要半天，比Southern杂交检测法快3-5天时间。
3.端粒和内参的检测在一管内完成，误差小。
4.使用PCR扩增，几乎每个分子生物学实验都有相关设备，非常方便。
5.本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。。
6.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品采用十孔盒包装
成分                                         编号           规格         包装
2×Probe qPCR MasterMix    981201        0.5 mL    0.5mL本色盖
荧光PCR专用模板稀释液      180701         1 mL     1.5mL绿盖管
超纯水                                   210806         1 mL     1.5mL蓝盖管
人端粒和内参引物干粉       yw230431        50次     0.5mL棕色管
使用手册                         15-230431sc      1份                无
注意:引物干粉在首次使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入 162uL 的超纯 水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。阳性对照需要单独放置，不要污染其他试剂。

自备试剂
样品DNA。

使用方法
一、待测样品DNA的制备
1.如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。用自选方法纯化样品的DNA。用PicoGreen法或NanoDrop仪器对回收的DNA进行纯度测定和定量。纯度必须达到OD260=1.7-1.9。然后统一稀释到50ng/uL，每次PCR用3uL。
二、稀释标准曲线样品
2.如果有N个样品，任选一个样本来稀释，作为标准品。
3.标记5个离心管，分别标注为1-5号，分别对应模板浓度25 ng/uL、12.5 ng/uL、6.3 ng/uL、3.2 ng/uL、1.6 ng/uL、0.8 ng/uL。
4.用带芯枪头分别加入50 μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头（下同）。
5.在1号管中加入50 μL 50ng/uL的阳性对照(第7步制备的N个样本中任选一个)，充分震荡1分钟，得1号标准曲线样品。放冰上待用。
6.换枪头，在2号管中加入1号标准曲线样品 (上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得2号标准曲线样品。放冰上待用。
7.换枪头，在3号管中加入2号标准曲线样品(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得3号标准曲线样品。放冰上待用。
8.重复上面的操作直到得到5个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
三、SYBR qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
9.强烈建议每个样本做3次重复，N样本则需要做3N+5+1个PCR反应，多出的5个是用于标准曲线样本，另外一个是无模板阴性对照。按下表加入各成分：
成分                                         样品管3N个管    标准曲线样本5个    阴性对照
2×Probe qPCR MasterMix          各10 μL              各10 μL                10 μL
端粒和内参引物混合液                各3 μL                各3 μL                  3 μL
待测DNA样本                              各3 μL                不加                      不加
标准曲线稀释液（1-5号）          不加                    各3μL                   不加
补超纯水                                     到20 μL              到20 μL                到20 μL

10.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
过程             温度    时间
第1步           95℃    15分钟
第2步
2次循环       94℃    15秒
                    49℃    15秒
第3步
32次循环     94℃    15秒
                    62℃    10秒
                    74℃    15秒，采集端粒扩增荧光信号
                    80℃    10秒
                    88℃    15秒，采集内参扩增荧光信号
第4步        熔解曲线分析
四、数据分析
11.熔解曲线分析：熔解曲线分析用于判断扩增是否有效。如果得到Tm分别为78℃（端粒PCR产物）和91℃（内参PCR产物）的两个峰，则表示实验有效，可以进入下一步分析。如果没有同时得到这两个峰，则表示扩增为非特异性扩增，实验无效，不需要分析Ct数据，需要找到原因后再继续实验。
12.制作标准曲线：以标准曲线样本浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制两条标准曲线，一条是用端粒的Ct值绘制，另外一条用内参的Ct值绘制。
13.确定待测样本浓度：通过标准曲线的公式，通过待测样本的端粒Ct和内参Ct，分别计算出样本中端粒的浓度和内参的浓度（ng数），再计算T/S值（即端粒浓度/内参浓度）。由于有三次重复，最后通过三个比值计算出每个样本T/S的平均值。
 
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