CAT#:JW-230428-1
低温运输，-20℃保存

2×染料法qPCR MasterMix（含RNase H）

产品及特点
本产品是基于荧光染料检测的即用型PCR试剂盒，可以对靶片段进行实时定量PCR分析。产品含有经过优化的缓冲液组分、Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、SYBR Green I及耐热RNase H等所有实时定量PCR所需要的成分，用户只需加入模板和引物即可进行实时定量PCR反应，具有广泛的用途。本产品具有下列特点：
1.方便，用户只需准备模板和引物即可以进行实时定量PCR实验。
2.含有耐热RNase H,可以抑制残存mRNA对PCR反应的作用。
3.产品为2×预配液，操作步骤已经最大限度地简化，能减少污染，降低实验误差。
4.扩增效率和灵敏度更高。
5.快捷，即用型的预配液使加样操作步骤简化，避免了交叉污染，降低实验误差。
6.各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。
7.本规格有1mL，足够100次20uL体系的染料法荧光定量PCR。
8.本产品只供科研使用。

规格及成分
本产品采用塑料袋包装
成份                                                                      编号     规格      包装
2×染料法qPCR MasterMix（含RNase H）    230428      1mL    1.5mL棕色管
使用手册                                                       230428sc    1份       1份

运输及保存
低温运输，-20℃保存,有效期一年。

自备试剂
DNA模板、引物、超纯水。

使用方法
1.如果有N个样品（最好含一个样本制备阳性对照和一个样本制备阴性对照）并且做定量分析，最好设置N+7个反应，多出的7个中，6个用于6点标准曲线，一个是扩增阴性对照（NC）。在N+7个PCR管中，加入下列成分。如果是做定性分析，则6个做标准曲线的样品缩减成一个扩增阳性对照（PC），用户自己需要根据下表进行适当修改（把6个标曲反应改成1个阳性对照反应）。
成分                                                                N个样品管        6个标准曲线管    NC管
2×染料法qPCR MasterMix（含RNase H）    各10uL                 各10uL             10uL
自备引物1（10uM）                                       各1uL                   各1uL                1uL
自备引物2（10uM）                                       各1uL                   各1uL                1uL
自备基因组DNA                                            10-100ng                不加                不加
或自备cDNA                                                   1-10ng                  不加                不加
自备阳性对照模板（6各梯度）                       不加                     各1uL              不加
阴性对照模板(一般用水)                                  不加                     不加                 1uL
自备50×自备ROX I或ROX II染料(见附)        各0.4uL                 各0.4uL           0.4uL
补超纯水到                                                      20uL                      20uL              20uL
2.放入荧光PCR仪中进行扩增,下表的扩增参数仅供参考。
循环步骤                       反应参数               备注
预变性                                 95℃                 5分钟    
PCR（35-45次循环）        94℃                 10秒    
                        55-65℃ 15-30秒              靶分子长度最好在80-200bp
                                       72℃ 40秒        （采集SYBR通道的荧光信号）
溶解曲线分析    按qPCR仪器手册执行
3.通过溶解曲线分析的结果排除无效数据。有Ct值，但Tm值跟扩增阳性对照Tm不一样的样品（包括对照和待测样品），归为假阳性，数据无效，不予以分析。Tm跟扩增阳性对照Tm一致的，为有效Ct。
4.如果两种阴性对照（样本制备阴性对照和扩增阴性对照）的溶解曲线所得Tm值跟扩增阳性对照的Tm值一样，说明环境或试剂可能有过去的PCR扩增产物污染，则此次实验无效，需要解决污染问题再进行实验。
5.如果两种阴性对照（样品制备阴性对照和PCR阴性对照）是假阳性，可以继续分析其它样品有效数据。
6.对定量检测，以6个标准曲线样品的浓度的log值为横轴，以有效Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的有效Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再换算出待测样品的DNA浓度。
7.对定性检测，则得到有效Ct值的样本为阳性，无有效Ct值的为阴性。

附：
下列信息仅供参考，具体以qPCR仪器的使用手册为准。
1．不需要ROX的机型：Agilent MX3000和MX4000、iCycler IQ、Light Cycler480、Smart Cycler System、Thermal Cycler Dice Real Time System 等型号的荧光PCR仪器不需要加ROX染料，但加入的话也不会影响整个PCR分析。
2.需要使用ROX I的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step One、Step One Plus。
3.需要使用ROX II的机型：ABI Prism7500、7500Fast、MJ Opticon、MJ Chromo4、Corbett Rotor Gene 3000。

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