CAT#:JW-221024-20
低温运输，-20℃保存

无缝克隆试剂盒

产品及特点
无缝克隆是一种简单、快速、高效的DNA定向克隆技术，该技术突破传统，不依赖内切酶和连接酶，不受限制性内切酶酶切位点的限制，利用同源重组的原理，可将任何DNA片段克隆至任何载体的任何位点。反应及转化时间短，阳性率达95%以上。此反应的示意图如下：

本产品特点总结如下：
1.简单、高效地定向克隆DNA片段。
2.可同时定向克隆两个或多个DNA片段。
3.不依赖内切酶和连接酶，不受限制性内切酶酶切位点的限制。
4.省时，反应时间加转化时间短至20分钟。
5.PCR产物（仅有目的条带、无非特异条带和引物二聚体）可直接进行重组反应，无需纯化。
6.本产品足够20次20μL体系的无缝克隆。
7.本产品只能用于科研。
规格及成分
本产品使用塑料袋包装
成份                        编号         规格           包装
2×无缝克隆Mix    221024a    200 μL    1.5 mL本色管
超纯水                210806        1 mL      1.5mL 黄盖管
使用手册             221024sc    1份            无

运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂
线性化载体、DNA片段、感受态细胞、SOC或LB培养基和培养皿（含抗菌素和不含的）

使用方法
一、线性化载体的制备：
可通过单酶切、双酶切或PCR扩增的方法来制备。（如果线性化不彻底，将会导致阴性克隆的产生，推荐使用双酶切或PCR扩增的方法。）
二、DNA片段的制备：
1.DNA片段可通过PCR扩增或酶切的方法制备，PCR扩增片段无需纯化即可用于重组反应。
2.PCR扩增法引物设计原则：引物的3’端必须包含18-50个能与模板DNA结合的碱基序列，以便PCR扩增出目的DNA片段。引物的5’端必须包含15-80个与线性化载体末端同源的碱基序列，以便PCR扩增片段能与线性化载体进行重组反应。
三、重组反应：
3.按照如下体系操作：
线性化载体                       50-100 ng
自备的DNA插入片段        X ng
2×无缝克隆Mix                10 μL
超纯水                           补足至总体积为20 μL
注意:目的片段与载体的摩尔比建议在2:1-3:1 之间。
当插入片段总和>5 kb 的时候，可适当延长孵育时间到 30-50 min。
4.50℃反应20分钟，然后将离心管放置于冰上2分钟。如当天不进行转化实验，请将连接产物放-20℃保存。
四、转化：
5.取4 μL连接液至50-100 μL刚刚融化的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟。
6.42℃水浴热激90秒。
7.立即放置于冰上静置5分钟。
8.加入500 μL无菌SOC或LB培养基（不含抗生素），37℃，200-250 rpm振荡培养45-60分钟。
9.吸取200 μL菌液涂板，为得到更多克隆，可先4000 rpm离心3分钟，弃掉部分上清，用移液器轻吹菌体，至充分悬浮，取全部菌液涂板，然后37℃培养过夜（12-16小时）。
10.用菌落PCR、直接测序或其他方法鉴定重组子。

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