CAT#:JW-221071-10
低温运输，-20℃保存

环状RACE试剂盒（PCR法）

产品及特点
确定基因的转录起始位点和终止位点是研究基因结构和功能的最重要工作之一，最通用的方法是Frohman发明Rapid Amplification of cDNA Ends。其用于确定转录起始位点的方法叫5′ RACE法，用于确定转录终点的方法叫3′ RACE法。它们是通过PCR快速克隆cDNA末端，在不建立cDNA文库的前提下，利用已知cDNA序列设计引物，通过向mRNA两端延伸和扩增获得两个末端的序列。但是要确定RNA两端的序列需要做两次RACE，为克服此缺点，本公司开发了环状RACE试剂盒，其原理如下：

本产品具有下列特点：
1.即开即用，客户只需要准备总RNA（或mRNA）和专一性引物，不需要单独准备其他试剂。
2.一次实验可以同时获得mRNA两端的序列。
3.通过适配子进行cDNA自连，不但效率高，而且测序时知晓哪里是自连位点。
4.本产品足够10次环状RACE实验（10次双链cDNA合成反应，20次环化反应，100次PCR反应）。
5.起始材料为纯化后的mRNA，用于需要准备两套PCR引物。
6.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品采用10孔盒加大塑料袋包装
成分                                   编号     规格      包装
环状RACE溶液A        221071a    20 μL      0.5 mL绿盖管
环状RACE溶液B        221071b    10 μL      0.5 mL白盖管
环状RACE溶液C        221071c    20 μL      0.5 mL红盖管
环状RACE溶液D        221071d    160 μL    0.5 mL白盖管
环状RACE溶液E        221071e    40 μL      0.5 mL黄盖管
环状RACE溶液F        221071f     10 μL      0.5 mL红盖管
微量核酸沉淀剂          220313     1 mL       1.5 mL白盖管
环状RACE溶液G        221071g    200 μL    0.5 mL黄盖管
环状RACE溶液H        221071h    10 μL     0.5 mL红盖管
2×染料法qPCR MasterMix    990408        0.5 mL    0.5 mL本色盖
超纯水                       210806       1 mL    1.5 mL蓝盖管
使用手册                     221071sc    1份    无

运输及保存
低温运输、-20℃保存、有效期一年。

自备试剂
目标RNA、基因专一性引物至少4条、75%乙醇。

使用方法
一：引物的设计和准备工作
1.利用已知道序列的区域设计基因专一性引物两套，方向向外（跟常规PCR向反），其中在距离5’端10-30个碱基设计的基因专一性引物叫5yw2，其下游100多个碱基设计的另外一对引物叫5yw1，两者同向，均向外扩增。在距离3’端10-30个碱基设计的基因专一性引物叫3yw2，其下游100多个碱基设计的另外一对引物叫3yw1，两者同向，均向外扩增。Tm最好为58℃。引物合成后需加超纯水溶解，使其浓度为10 μM，然后1：1混合后，放冰上待用。没有用完的放-20℃保存。5yw1和3yw1混合得PCR引物混合液，5yw2和3yw2混合得巢式PCR引物混合液。
二：逆转录制备cDNA
2.在一个PCR管中，加入以下组分：
成分                                        用量
自备样品mRNA或RNA       6 μL（0.5-2μg）
环状RACE溶液A                    2 μL
环状RACE溶液B                    1 μL
70℃ 2分钟后室温放置2分钟，短暂离心
加入环状RACE溶液C            1 μL
轻柔吹打混匀后42℃保温90分钟
超纯水                                    49 μL
环状RACE溶液D                   16 μL
环状RACE溶液E                    4 μL
共79μL。吹打混匀后，短暂离心，16℃保温2小时，加入环状RACE溶液F 1μL，总体系80μL，16℃保温5分钟，70℃保温5分钟
三：沉淀法回收cDNA
3.加入160μL微量核酸沉淀剂，颠倒10次混匀后，15000g离心10分钟后小心弃上清。
4.加入1mL自备的75%乙醇，颠倒10次混匀，15000g离心3分钟后小心弃上清。
5.再短暂离心10秒，小心吸弃残留上清（约50μL）。
6.加入40μL超纯水溶解DNA沉淀，所得溶液即为待环化cDNA溶液。将此溶液分成两个管，每管20μL，一管标为环化样本，另一管标为非环化对照。
四：cDNA的环化
7.在上述两管中（各含有20 μL cDNA溶液）加入以下组分：
成分                   环化样本管    非环化对照管
超纯水                    68 μL        70 μL
环状RACE溶液G    10 μL        10 μL
环状RACE溶液H    2 μL        不加
8.16℃保温16小时，65℃10分钟，最后得环化样本原液和非环化样本原液。
五：第一轮PCR扩增
9.在3个PCR管中，分别加入以下组分：
成分                                    1号环化模板    2号非环化样模板    3号无模板
超纯水                                    6 μL                 6 μL                    8 μL
自备PCR引物混合液              2 μL                2 μL                    2 μL
上步所得环化样本原液           2 μL                -                           -
上步所得非环化样本原液          -                   2 μL                      -
2×染料法qPCR  MasterMix    10 μL            10 μL                  10 μL
合计                                    20 μL                 20 μL                  20 μL
10.按下列条件进行qPCR（注：应根据自备引物的Tm值选择适当的退火温度，下面的参数仅仅供参考）。
第1步：94℃ 5分，48-52℃ 2分，72℃ 4分，设置一次循环
第2步：94℃ 40秒，52-60℃ 1分，72℃ 3分，设置40次循环，在复性步骤采集SYBR通道的荧光信号。
11.如果SYBR荧光信号呈现倒S型，则在其刚达到平台时终止PCR，即使循环数还没到设置的40次循环。如果SYBR通道没有荧光信号或到40次循环时荧光信号还没有到达平台，则按设置的40次循环进行PCR，按时结束。
12.PCR结束后，电泳检测。如果有清晰的、RACE专一的扩增产物（只有1号管有，而2号和3号管没有的DNA条带），则直接胶回收、克隆、选10个转化子进行质粒测序。如果有多条清晰的、RACE专一的扩增产物条带，则优先选择分子量最大的条带。如果没有RACE专一的扩增产物条带，则再进入下步。
六：巢式PCR    
13.在3个PCR管中设置如下反应：
成分                                    4号管    5号管    6号管
超纯水                                   6 μL    6 μL     6 μL
巢式PCR引物混合液             2 μL    2 μL     2 μL
第一轮PCR 1号管反应液      2 μL         
第一轮PCR 2号管反应液                  2 μL    
第一轮PCR 3号管反应液                                 2 μL
2×染料法qPCR MasterMix    10 μL    10 μL    10 μL
合计                                       20 μL     20 μL    20 μL
14.按下列参数进行PCR：94℃ 2分钟，（94℃ 30秒，50℃ 30秒，68℃ 2分）40个循环，在复性步骤采集SYBR通道的荧光信号。
15.如果SYBR荧光信号呈现倒S型，则在其刚达到平台时终止PCR，即使循环数还没到设置的40次循环。如果SYBR通道没有荧光信号或到40次循环时还没有到达平台，则按设置的40次循环进行PCR，按时结束。
16.PCR结束后，电泳检测。如果有清晰的、RACE专一的扩增产物条带（只有4号管有，而5号和6号管没有的DNA条带），则直接胶回收、克隆、选10个转化子进行质粒测序。如果有多条清晰的、RACE专一的扩增产物条带，则优先选择分子量最大的条带。如果没有RACE专一的扩增产物条带，则需要将第一轮PCR得到的3管PCR产物分别稀释10倍，100倍，1000倍后，再取2 μL为模板进行巢式PCR，共9个扩增。然后寻找RACE专一的扩增产物条带。
17.得到专一条带克隆和测序结果后，再进入下一步。
七：序列分析
18.测序得到的结果同时包含了目标RNA 的3端序列、逆转录引物序列和目标RNA 的5端序列，故需要根据已知的逆转录引物序列和它们的相对位置关系，先将三者分开。它们的相对位置关系如下：

         RNA 3端            逆转录引物互补链（含polyA序列）               环化接口   RNA 5端
5 NNNNNNNNNAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTTGAGCTCGAGTCCTCGTCACTCTGCTCACTGG  NNNNNNNNNNNNNNN 3
3 NNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTCGAACTCGAGCTCAGGAGCAGTGAGACGAGTGACC  NNNNNNNNNNNNNNN 5
                                  逆转录引物（含polyT）

19.上图逆转录引物互补序列（含polyA）左侧的区域到PCR F引物结合位点之间的这段区域为目标RNA的3端序列。不排除逆转录引物跟RNA中间的富含A的区域结合，这样得到的序列不一定是RNA的3端，但这种情况只占少数。由于是对多个克隆进行测序，因此大多数序列还是目标RNA的3端序列。
20.上图断裂处为环化位点，该位点右侧直到PCR R引物结合位点之间的这段区域为目标RNA 5端的序列。
21.将每个克隆得到的目标RNA 3端和5端序列跟目标RNA的已知序列（设计引物所使用的序列）、RACE引物序列、RNA对应的基因组DNA序列（如果有的话）等一起进行多重比对，确定它们彼此的相对位置和同源序列。
22.如果有必要，可以用得到的新的RNA序列再设计新的RACE引物，继续用本试剂盒克隆未知区域的序列。

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