CAT#:JW-221142-10
低温运输，-20℃保存

一管式点突变试剂盒

产品及特点
基因的定点突变是重要的分子生物学技术，广泛用于载体构建、基因改造、蛋白质功能研究等领域。但传统的方法需要使用单链DNA模板，而得到单链DNA模板又需要先将基因克隆到类似M13这种载体中，操作过程冗长。为了克服这些缺点，本公司将突变位点设计到一对互补的引物中，用超保真PCR体系扩增甲基化质粒模板，然后用Dpn I限制性内切酶去除原始的甲基化模板，新合成的非甲基化DNA通过互补形成带切口的双链质粒，直接用于转化感受态细菌。本方法过程示意图如下：

本产品具有下列特点：
1.直接使用质粒DNA作为模板，免去了制备单链DNA的步骤。
2.基于高保真PCR，对模板DNA序列没特殊要求，可以用于突变任何序列。同时对模板的需求量很少。
3.一管式，全部在一个优化的缓冲体系中完成，非常简单。
4.使用Dpn I去除未突变模板，突变效率高达90%。
5.可用于制备点突变，缺失突变和插入突变。
6.本产品适用于10-15 kb的片段。
规格及成分
成份                                                        编号      规格      包装材料
点突变专用DNA聚合酶                     221142a    10 uL     0.5mL红盖管
2×点突变PCR Buffer（含dNTP）    221142b    200 uL    0.5mL绿盖管
Dpn I 限制性内切酶                          221142c    10 uL     0.5mL紫盖管
超纯水                                              210806      1 mL      1.5mL黄盖管
使用手册                                          221142sc    1份        无
本产品使用五孔盒包装

运输及保存
低温运输、-20℃保存, 有效期一年。

自备试剂
质粒DNA、突变引物、细菌转化试剂

使用方法
一、 引物设计及注意事项
用于特定基因突变的引物必须用户单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计。
1.共需设计两条完全互补的一对引物，它们覆盖要扩增的突变区位点，突变位点最好放在引物的中心。可以先设计一条，然后就可得互补的另一条引物。
2.引物的长度通常为25-45个碱基。引物中突变位点任何一侧都必需满足Tm 大于45℃的条件，Tm计算方式为Tm=4×(GC碱基数)＋2×(AT碱基数)。例如引物agtcaggccaattcgAAGcagtcgaattgccaag就达到此标准，它的突变位点AAG所放位置使左侧Tm＝46；右侧Tm＝48，均大于45℃。
3.尽量把引物的GC含量控制在40％-60％，结尾的1-3个碱基最好是G或C。
4.尽量使引物不要产生非常稳定的二级结构和引物二聚体。
5.最好使用经过PAGE纯化的引物或更高纯度的引物。
二、待突变模板质粒的选择
6.必须使用从dam＋基因型的大肠杆菌中制备得到的质粒（甲基化）用于基因定点突变PCR的模板，如果使用dam-基因型的大肠杆菌制备的质粒，由于其未甲基化，Dpn I限制性内切酶不能把质粒DNA切除，这些模板质粒也能转化形成转化子，产生大量的假阳性，严重干扰后续的筛选。实验室常用的大肠杆菌大多数都是dam+基因型，包括DH5α、JM109等，常用的dcm-大肠杆菌只有DM1、INV110、JM110等SCS110等少数几种。
7.待突变质粒和目的基因的GC含量应该在40-55％，没有任何 GC含量超过70%、长度在50bp以上的区域。如果质粒GC含量过高，请先把目的基因克隆到其它合适的载体上，再进行基因定点突变反应。如果目的基因GC含量过高，而突变位点不在高GC含量区域，可以先把该基因的不含高GC含量的一个区域克隆出来，进行定点突变，然后再把突变后的片断克隆回原基因中。如果突变位点在高GC区，则可以使用高GC专用PCR反应试剂。
三、 基因定点突变反应（40uL体系）
8.在一个塑料离心管中加入下列成分：
成分                                                 加入量
待突变模板质粒                                0.1-0.5 ug
2×点突变PCR Buffer（含dNTP）    20 uL
自备引物一和引物二 (10 uM)            各1 uL
点突变专用DNA聚合酶                     1 uL
补自备超纯水到                                40 uL
9.放入PCR仪器中按下面参数进行PCR：
步骤                              温度    时间    循环数
变性                              95℃    1分钟    1次
PCR
（注：只18次循环）    95℃    40秒    18次
                                     60℃    1分钟    
                                     68℃    1分钟/Kb    
延伸                             72℃    10分钟    1次
保存                              4℃    长时间保持    
四、Dpn I限制性内切酶消化：
10.PCR反应后，直接在PCR反应体系中加入1uL Dpn I限制性内切酶 （该酶在甘油保存液中会下沉到管底，故用前需要充分混匀），混匀后37℃孵育2小时后样品可以直接用于转化，或者-20℃保存备用。。DpnI限制性内切酶可以酶切双链都被甲基化的模板质粒，也能降解一条链被甲基化的双链质粒。
五. 转化、挑克隆鉴定：
11.每100uL感受态细菌（转化效率必须在10E7 /ug以上）中可以加入5-10uL经过Dpn I消化后的突变产物，按照所使用的感受态细菌的操作方法进行操作。强烈建议使用能限制甲基化质粒的宿主菌（mcrA+或macBC+基因型，如DH5、HB101、JM109等），最后不要使用丢失了基于甲基化的限制性功能的宿主菌（mcrA-或macBC-基因型，如DH10B、INV110、SURE、Tg1、XL10-Gold），这样只有非甲基化的突变质粒才能扩增，可以使阳性率提高到95%左右。在涂板前通过离心浓缩的办法，把所有被转化后的细菌全部涂布到含有适当抗生素的平板上培养过夜。通常会得到50个以下的克隆，可按常规方法制备质粒并测序。
六、常见问题：
12.转化后没有克隆或克隆数极少：(1) 感受态细菌效率不够高，请检测一下感受态细胞的效率，确保转化效率在10E7转化子/ug。(2) 把Dpn I消化后的产物用常规的乙醇沉淀浓缩，这样就可以把所有的产物全部用于转化。(3) 优化基因定点突变中的PCR参数。可以把最初的95℃变性时间延长为2分钟，循环中95℃变性的时间延长至1分钟，把循环中的68℃的延伸时间改为1.5分钟/kb 至2分钟/kb，退火可以改为60-55℃或65-55℃等的touch down，退火时间也可以适当延长。(4) 引物设计有问题。通过突变反应中的PCR没有很好地扩增出预期的突变质粒。