CAT#:JW-221123-30
常温运输和保存

Blue-Native PAGE电泳试剂盒（BN-PAGE）

产品及特点
Blue Native PAGE（BN-PAGE）电泳是分离多亚基蛋白质复合物的一种特殊的非变性梯度PAGE电泳方法，其原理是使用温和的非离子型表面活性剂将蛋白质复合物与细胞膜分离，再用考马斯亮蓝G-250助溶并使蛋白质复合物带负电荷，在电泳时向阳极泳动，直到进入孔径直径跟自身直径相当的凝胶区域时停止。BN-PAGE比其他分离多亚基蛋白质复合物的技术（如排阻层析和密度梯度电泳）具有更高的分辨率，因此得到日益广泛的应用。为方便使用，本公司开发了BN-PAGE试剂盒，它具有下列特点：
1.一站式，用户用于不需要单独准备各种成分，不需要单独优化各种条件，即开即用，十分方便。
2.本试剂盒使用Triton X-100作为温和的非离子型表面活性剂。如果用户使用其他表面活性剂制备样品，则需自行测试其兼容性。
3.可以分离分子量在10 kDa到10000 kDa（10MDa）之间的蛋白复合物。
4.BN-PAGE电泳后条带自然成蓝色，不需要染色，可以直接观察。
5.切下的条带可以可以用于蛋白回收，也可以再进行常规的SDS- PAGE电泳，分离蛋白复合物的组成亚基。
6.可以对BN-PAGE电泳胶进行考染、银染、Western杂交或活性检测。
7.本产品足够30次0.16cm×14cm×14cm大小的BN-PAGE电泳。
8.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品第一部分，编号221123pt1，大纸盒包装，常温运输和保存。
成份                                                  编号               规格                包装
丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺           221123a            98g+3g       250mL棕塑瓶
TEMED                                       110-18-9               1mL         1.5mL白色盖
过硫酸铵                                     100879                 1 g           1.5mL绿色盖
20% Triton X-100溶液                 221123b              1mL         1.5mL黄盖管
5% CBB G-250溶液                    221123c               1mL         1.5mL棕色管
50%甘油溶液                               221123d              1mL         1.5mL白盖管
3×BN-PAGE配胶缓冲液               221123e              250mL    250mL本色瓶
BN-PAGE阴极电泳液A                221123f1               250mL    250mL本色瓶
BN-PAGE阴极电泳液B                221123f2               250mL    250mL本色瓶
BN-PAGE阳极电泳液                   221123g               250mL    250mL本色瓶
使用手册                                    221123sc               1份                无
本产品第二部分                        221123pt2，塑料袋包装，低温运输，-20℃保存。
成份                                   编号       规格                包装
BN-PAGE上样液        221123h      1.5 mL      1.5mL本色管

运输及保存
大纸盒部分常温运输和保存，塑料袋部分低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂
梯度灌胶仪、去离子水

使用方法
一、样本制备
1.本试剂盒不含样本制备相关试剂，但由于样本制备对BN-PAGE电泳非常重要，只有样品制备得到了完整的蛋白复合体，才有可能在BN-PAGE电泳胶上出现相应的条带。如果在样本制备时蛋白复合体就已经解离，再好的BN-PAGE电泳也不可能将其检测出来。因此特别提醒用户在样本制备时注意以下事项：
第一、首次制备样本时还需要测试三个Triton X-100浓度：下表中所推荐的浓度、减半的浓度、加倍的浓度，然后根据实验数据择优使用：
样本类型                   Triton X-100终浓度
人全细胞裂解物                0.1%
哺乳动物线粒体                1.0-2.4%
植物线粒体                        0.5%
叶绿体                               0.8%
酵母过氧化物酶体              0.2-1.0%
酵母微粒体                         0.2-1.0%
第二、样本制备所用溶液最好使用钠盐和锂盐，避免使用钾盐和二价金属盐，因为它们可能会使使CCB G-250染料或蛋白-染料复合体沉淀。如果制备的样本已经含有高盐，最好前先透析脱盐再使用。
二、样本的上样前溶解
2.对线粒体或细胞膜样本：在蛋白总量为400ug的线粒体或细胞膜沉淀中加入40uL BN-PAGE上样液，充分匀浆，然后加入适量20% Triton X-100溶液（动物线粒体加6uL，酵母线粒体加4.8uL，细菌细胞膜加4uL），室温放置10分钟溶解样品。然后加入5uL 50%甘油，最后加入适量5% CBB G-250溶液（动物线粒体加3uL，酵母线粒体加2.4uL，细菌细胞膜加2uL）。电泳时每孔上样20uL。
3.叶绿体样本：在蛋白总量为500ug的叶绿体沉淀中加入50uL BN-PAGE上样液，充分匀浆，然后加入2.5uL 20% Triton X-100溶液，室温放置10分钟溶解样品。然后加入5uL 50%甘油，最后加入1.25uL CBB G-250。电泳时每孔上样20uL。
三、制备BN-PAGE梯度胶
4.首次使用本试剂盒时，需要按下述流程配制10%的APS（过硫酸铵）和丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液：
新鲜配制10%的APS：称量约0.1克硫酸铵干粉到一个1.5 mL 塑料离心管中，按每0.1克过硫酸铵干粉加1mL自备去离子水的比例将水加到管中，颠倒摇晃到硫酸铵粉末全部溶解。配制好的10%的APS溶液可以在4℃存放一周，超过一周则不能再用。
新鲜配制丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液（T=49.5%，C=3%）：在装有丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的棕色塑料瓶中，加入146 mL自备的去离子水，充分摇晃直到溶解（约需10-20分钟）。此溶液简称为AB溶液，最好在一个月内用完，4℃保存。
5.根据所要分离的蛋白复合体的分子量大小按下表选择所需BN-PAGE胶的浓度范围。
样本分子量范围    浓缩胶浓度    梯度分离胶浓度范围
10-500 kDa           4.0%                6%-18%
10-1000 kDa         4.0%                5%-13%
10-3000 kDa         3.5%                4%-13%
10-10000 kDa        3%                  3%-13%
6.下面以浓缩胶为3.5%、分离胶浓度为4%-13%的BN-PAGE为例说明制备两块0.16cm×14cm×14cm梯度胶的配制方法。如配制其他浓度的胶，各成分用量需按比例调整。
7.先根据下表制备三种制胶液：
成分                                     3.5%浓缩胶    4%母液    13%母液
3×BN-PAGE配胶缓冲液            2mL          6mL           5mL
AB溶液                                    0.44mL        1.5mL       3.9mL
自备去离子水                          3.4mL          10.4mL      3.0mL
灌胶前加10%APS                   50uL           100uL         75uL
灌胶前加TEMED                     5uL             10uL           7.5uL
总体积                                     6mL            18mL         15mL
8.根据梯度灌胶仪手册用4%母液和13%母液制备4%-13%的梯度胶，混合灌胶前才能加10%APS和TEMED。灌胶后胶上层需要盖上水以隔绝空气（因为氧气可以抑制聚合），水比胶轻，自然在上层。常温聚合30分钟。
9.倒掉上层的水后再在已经凝固的梯度分离胶上灌入3.5%的浓缩胶，灌胶前才能加10%APS和TEMED，灌胶后立即插上样品梳。需要根据实验目的是分析还是制备选择相应类型的梳子。室温聚合15分钟。
四、BN-PAGE电泳
10.胶凝固后，将胶板固定到电泳架上，往上槽和下槽中分别加入足够的BN-PAGE阴极电泳液A（上槽）和BN-PAGE阳极电泳液（下槽）。
11.小心拔出梳子后用槽中缓冲液吹加样孔。
12.小心将溶解在BN-PAGE上样液中的样品上样。
13.将电压设置为100V并开始电泳。
14.等蓝色样品进入凝胶后再将电流调到15mA，电压调到500V。
15.当蓝色泳动条带的前沿移动到胶长度的1/3位置的时候，关掉电源，吸出上槽的BN-PAGE阴极电泳液A（可以4℃保存，再使用2-3次），加入BN-PAGE阴极电泳液B。打开电源，继续电泳。
16.如果后续还要进行蛋白纯化、Western转膜、第二相电泳等需要蛋白移位的实验，则只能再电泳2小时。此时蛋白聚合物还没到达到孔径直径跟自身直径相当的凝胶区域，在后续处理时还能够移位。
17.如果后续只是染色观察，则可以再电泳4小时，蛋白聚合物最终将移动到孔径直径跟自身直径相当的凝胶区域。由于蛋白聚合物相当于被凝胶卡住，没法再移位，因此只能进行原位检测，不能进行需要移位的检测。
18.停止电泳后，对BN-PAGE胶进行后续操作，本产品不提供相关试剂。由于CBB G-250染料会很快扩散，蛋白复合体条带也将很快变淡，因此需要快速进行需要颜色指导的操作（如切胶等）。

关联试剂
核酸银染试剂盒