CAT#:JW-221104
低温运输，-20℃保存

全转录组扩增试剂盒（T7法）

产品及特点
一个细胞所含的所有转录产物又叫转录组Transcriptome，对其进行二代测序是研究基因表达的最新方法，但是很多样品（FACS分离的细胞、FFPE切片或少量细胞样品）细胞数量有限，质量不高，并且还没法进行第二次取样，所以常常需要先进行全转录组扩增Whole Transcriptome Amplification。WTA的方法之一是T7转录法，它既可以得到反义aRNA（Antisense Amplified RNA），也可以再以反义aRNA为模板继续得到正义aRNA。其制备反义aRNA的原理图如下：

本产品就是根据T7体外转录技术研发的WTA试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户不需要单独准备每个成分并进行优化。
2.只需要半天即可制备反义aRNA（相当于mRNA的互补RNA链），只要一天即可制备正义aRNA（相当于mRNA）。
3.以50ng mRN为模板一般能制备10ug左右的、长度在200-1500bp之间的反义aRNA；以50ng aRNA为模板一般能制备40ug左右的、长度在200-1000bp之间的正义aRNA。
4.能保持RNA样品中各分子的相对丰度，Pearson相关性系数一般在0.9-0.95以上（跟起始模板用量、制备的是反义还是正义aRNA相关）。
5.体外转录时加入自备的标记UTP，可以制备标记的aRNA。
6.扩增得到的单链RNA能直接用于各种后续试验，包括NGS、qRT-PCR、芯片表达分析、杂交反应等。
7.本产品足够做20次全转录组扩增（制备反义aRNA算一次，再制备正义aRNA算两次）。
8.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品使用塑料袋包装，含两个部分
第一部分无包装
名称                        编号              规格        包装
微量核酸沉淀剂    220313           10mL    10mL本色瓶内
使用手册               221104sc        1份         无
第二部分用10孔盒包装
名称                                                            编号            规格            包装
cDNA第一链合成反应液（含dNTP）        220627a     40 μL      0.5 mL绿盖管
T7-Oligo-dT引物干粉                                221104a     20此        1.5mL本色管
MMLV逆转录酶，200U/μL                     11-220628     20 μL      0.5 mL红盖管
5×cDNA二链合成缓冲液                           220627b     160 μL    0.5 mL白盖管
20×cDNA二链合成酶混合液                    220627c      40 μL       0.5 mL黄盖管
E.coli外切酶I，20U/μL                             220732a     40 μL       0.5 mL红盖管
微量核酸沉淀剂                                        220313      10mL       10mL本色瓶内
2×T7 体外预配液                                     211214a     0.5 mL      0.5 mL绿盖管
T7 RNA聚合酶-RI混合液                         91106c       50 μL        0.5 mL红盖管
RNase-free水                                           980403      1 mL           1.5 mL蓝盖管

运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期为1年。

自备试剂
75%乙醇，RNA纯化试剂盒，RNase-free DNase

使用方法
一：样品RNA的制备（本产品不含相关试剂）
1.总RNA样品的浓度必须在500pg-50ng/μL，一次反应所需总RNA的量为500pg-50ng。RNA的RIN值最好在2以上。
二：一管式双链cDNA的合成
2.在0.5mL PCR管中，按下表设置双链cDNA合成反应，用户可以根据需要设置阴性对照。注意：首次使用本试剂盒时需要在T7-Oligo-dT引物干粉管中加入20μL RNase-free水溶解引物得到0.1ug/μL，然后根据每次实验的用量再稀释部分到所需的浓度。T7-Oligo-dT引物所需量按每2ng RNA加1ng 引物的比例加，如果模板RNA（含mRNA）是50ng，则加25ng引物。如果模板总RNA（含mRNA）是10ng，则加5ng引物。
成分                                                                    用量
自备的总 RNA                                                   1 μL（500pg-50ng）
T7-Oligo-dT溶液，Xng/μL                                1 μL
65℃ 5 分钟后室温放置 2 分钟，短暂离心后放 4℃
cDNA第一链合成反应液（含dNTP）                2 μL
MMLV逆转录酶，200U/uL                                 1 μL
总体积5μL。轻柔吹打混匀后4℃ 2分钟，25℃ 30分钟，42℃60分钟逆转录，70℃15分钟灭活酶，再加入下列成分：
RNase-free水                                                  25 μL
5×cDNA二链合成缓冲液                                   8 μL
20×cDNA二链合成酶混合液                             2 μL
总体积40μL。轻柔吹打混匀后，短暂离心，4℃保温1分钟，25℃保温10分钟，50℃保温30分钟，80℃灭活20分钟，最后4℃放置待用。所得为双链cDNA产物。
超纯水                                        38 μL
E．coli外切酶I，20 U/μL            2 μL
总体积80μL，37℃ 60分钟，
三：双链cDNA的纯化
3.在80μL样品中加入180 μL微量核酸沉淀剂，颠倒混匀后室温15000g离心15分钟，小心去上清。再加入1mL 自备的75%乙醇，15000g离心3分钟，小心去上清。短暂离心，小心去残留上清约50 μL。敞开盖子短暂放置3分钟，加入20 μL RNase-free水溶解沉淀，然后定量，再用部分或全部cDNA溶液作为模板进行体外转录。
四：T7体外转录（50μL反应体系）
4.按下表设置50μL的体外转录反应，用户可以根据需要设置阴性对照：
成分                                     用量
cDNA模板                            1-20 μL
2×T7转录预配液                   25 μL
T7 RNA聚合酶-RI混合液      2.5 μL
RNase-free水                        补到50 μL
5.42℃保温4小时。注意：不要超过4小时，否则T7 RNA聚合酶将降解掉合成的RNA。
五：后续实验
1.长度检测：取5μL T7扩增产物进行PAGE电泳检测。标准的反应结果是产生长度在200-1500bp之间的产物。
2.PCR检测：如果产物将用于RT-PCR，则可以不经过纯化直接稀释后。
3.浓度和纯度检测：加入RNase-free DNase降解DNA模板，用过柱法或酚氯仿抽提-乙醇沉淀法纯化RNA，去除DNA、引物和dNTP，在OD260的波长下测样品光吸收。由于扩增产物是反义单链RNA，故1OD260=40μg /mL。所得DNA可以放-20℃长期放置。
4.正义aRNA制备：用纯化的反义aRNA为模板，用试剂盒进行扩增，得到的就是正义aRNA。

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