CAT#:JW-220998
常温运输和保存，BSA需低温运输

蛋白浓度测定试剂盒（BCA超敏法）

产品及特点
本产品是在BCA法蛋白定量试剂盒基础上改进的超敏蛋白定量试剂盒，尤其适合对低浓度的蛋白质溶液进行定量分析。其原理是蛋白质分子在碱性条件下将二价Cu离子还原为一价Cu离子 (双缩脉反应) ，一个一价Cu离子再与二个BCA分子鳌合产生一种在吸收波长为562 nm的紫色水溶性产物，根据紫色水溶性产物的浓度反推出蛋白质的浓度。BCA法原理示意图如下：

本产品具有下列特点。
1.超敏感，最低检测浓度为0.5 μg/mL。
2.线性范围在0.5～20 μg/mL，尤其适用于低浓度的样品。
3.对大多数离子型和非离子型去污剂不敏感，但对Cu的还原剂和螯合剂敏感。
4.比Lowry法更加简单快捷，45分钟内完成测定。
5.试剂稳定，但工作液1天内有效。
6.终产物稳定，检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。
7.最短可以检测双肽，所以适合于分子量较小的蛋白质，而Bradford法需要一定大小的蛋白质。

规格及成分
本产品采用小扁盒包装
成份                                                               编号       规格    包装材料
超敏BCA蛋白定量溶液A                            220998a    50 mL    60 mL本色瓶
超敏BCA蛋白定量溶液B                            220998b    50 mL    60 mL本色瓶
超敏BCA蛋白定量溶液C                            220998c    2 mL     2 mL棕色管
牛血清白蛋白(BSA)标准品（2 mg/mL）    220565     1 mL     1.5 mL本色管
使用手册                                                   220998sc    1份       1份

运输及保存
常温运输和保存，但BSA标准品需要低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂
样品缓冲液

使用方法
1.用合适的方法制备待测蛋白样品，并把蛋白质溶解在合适的样品缓冲液中。本检测方法受待测样品中螯合剂和还原剂的影响，所以需确保待测蛋白溶液中EDTA的终浓度不高于10 mM、二硫苏糖醇不高于1 mM、β-巯基乙醇不高于1 mM，没有任何 EGTA。如果达不达上述要求，则需要稀释样品，使其浓度降低到上述浓度之下。
2.将本试剂盒提供的BSA标准品（2 mg/mL）10 μL和490 μL自备的样品缓冲液（用于溶解待测样品的溶液）混合，得到500 μL浓度为0.04 μg/μL的BSA工作液，放冰上待用，用于制备标准曲线。上述量足够一次实验使用。此BSA工作液每次实验均需要新鲜配制。
3.配制超敏BCA工作液：先计算一次检测所需BSA工作液的体积。如果有N个样品，每个样品只做一次重复，再加上7个标准曲线样品，一般多准备10%的量，故一次检测所需BSA工作液的体积为：0.15 mL×（N+7）×110%。配制时将超敏型BCA蛋白定量溶液A、超敏型BCA蛋白定量溶液B和超敏型BCA蛋白定量溶液C按50：48：2的比例混合得到到所需体积即可。如果需要10 mL，则三种溶液体积分别为5 mL、4.8 mL、0.2 mL，所得溶液即超敏BCA工作液。
4.取一块96孔板，按下表加入上步新鲜制备的BSA工作液、N个待测蛋白样品和自备样品缓冲液：
编号  BSA工作液（μL）  N个待测样品（μL）   样品缓冲液（μL）   总体积（μL）   蛋白含量（μg）
0                   0                         0                              150                       150                   0
1                   5                         0                              145                       150                   0.2
2                   10                       0                              140                       150                   0.4
3                   20                       0                              130                       150                   0.8
4                   40                       0                              110                       150                   1.6
5                   60                       0                              90                         150                   2.4
6                   80                       0                              70                         150                   3.2
7                   100                      0                             50                         150                   4.0
N个待测样品  0                       ？μL                    补到150                     150                   待测
5.在每个孔中（总体积为150 μL）加入等体积的超敏BCA工作液并混匀。如果用排枪加入并混匀则更好。也可把96孔板放在振荡器上振荡30秒混匀。
6.60℃放置1小时。本试剂受温度和时间影响较大，故需要准确定时和定温，以保证精确定量。
7.冷至室温，迅速在562 nm下比色测定所有样品的光吸收。如酶标仪没有562 nm的设定，可用接近的波长检测，如570 nm。测定操作最好在10分钟内完成，否则化学反应还在继续进行，光吸收值每10分钟会升高2.5%左右。
8.处理数据：将编号为0号的样品（对照）的读数从其余所有样品（包括0号样品，其读数变成零）中扣除。
9.制作标准曲线：以0-7号样品的BSA含量（单位μg，见上表最右行）为横坐标，0-7号样品吸光值（扣除背景读数的）为纵坐标，绘出BSA的标准曲线。
10.再将N个待测样品的吸光值（减去0号样品的读数后）标在标准曲线上，其在横坐标上对应的蛋白含量（μg）就是待测样品中的蛋白质含量，除以样品稀释液总体积（20 μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度，单位为 μg/μL。

二：注意事项
11.第5步加BCA工作液后也可以在室温放置2小时，或60℃放置30分钟。超敏BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。所以，如果蛋白质浓度较低，可以改在60℃孵育60分钟。
12.待测样品浓度在20～2000 μg/mL范围时有较好的线性关系。
13.超敏BCA法测定蛋白浓度时，不受下列化学物质的影响：
名称                                         浓度小于下面数值时不受影响
Ammonium S μLfate                      1.5 M
Brij-35                                            5.0%
CHAPS                                          5.0%
EDTA                                            10 mM
Hepes                                           100 mM
Glycine, pH 2.8                             100 mM
Guanidine HCl                              4.0 M
Tween 20、60、80                       5.0%
SDS                                              5.0%
Sodium Acetate pH 5.5                 200 mM
Sodium Chloride (NaCl)                1.0 M
Sucrose                                         40%
Sodium  Hydroxide (NaOH)           0.1 M
NP-40                                            5.0%
Triton X-100                                   5.0%
Urea                                               3.0 M

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