CAT#:JW-221142-10
低温运输，-20℃保存

一管式点突变试剂盒

产品及特点
基因的定点突变是重要的分子生物学技术，广泛用于载体构建、基因改造、蛋白质功能研究等领域。本产品就是专门用于从含有野生型DNA插入片段的质粒DNA快速制备突变（包括点突变、插入突变和缺失突变）的试剂盒。其原理示意图如下：

本产品具有下列特点：
1.直接使用质粒DNA作为模板，不需要专门制备插入DNA片段。
2.使用超保真酶，PCR过程中不会引入突变。
3.基于PCR扩增，对模板DNA序列没特殊要求，可以用于突变任何DNA位点。
4.模板DNA的需求量很少，只需要1pg-10ng。
5.突变效率高达90%。
6.不但可以制备点突变，还可以制备缺失突变和插入突变。
7.本产品适用于长度为10-15 Kb的DNA（包括质粒的长度）。
8.本产品足够10次点突变实验。
9.本产品只能用于科研。
规格及成分
本产品采用五孔盒包装
成份                                            编号      规格                包装
10×质粒DNA修复反应液       221142a     20 L     0.5 mL白盖管
质粒DNA修复酶                    221142a     20 L     0.5 mL红盖管
2×超保真PCR MasterMix     220649       200 L    0.5 mL绿盖管
质粒DNA处理液                    221142c     20 L      0.5 mL黄盖管
超纯水                                   210806       1 mL    1.5 mL蓝盖管
使用手册                               221142sc    1份       无

运输及保存
低温运输、-20℃保存，有效期一年。

自备试剂
质粒DNA、突变引物、细菌转化试剂

使用方法
一、引物设计及质粒DNA质量
1.共需设计两条完全互补的一对引物，它们要覆盖突变位点，突变位点最好放在引物的中间位置。可以先设计一条，然后通过反向互补原则得到另一条引物。
2.引物的长度通常为25-45个碱基。引物中突变位点左右侧都必需满足Tm大于45℃的条件。例如引物agtcaggccaattcgAAGcagtcgaattgccaag就达到此标准，突变位点AAG左侧Tm＝46；右侧Tm＝48，均大于45℃。
3.引物的GC含量在40％-60％之间，最3端的1-3个碱基最好是G或C。
4.引物不能产生非常稳定的二级结构，也不能在PCR时形成引物二聚体。
5.引物必须HPLC纯化。
6.本方法是以质粒DNA为模板进行PCR扩增，因此质粒DNA完整性非常重要。如果质粒DNA有大量的nick或gap（限制性内切酶酶切双链DNA不能发现某条单链DNA上是否有nick或gap），则本方法的成功率将会降低。如果质粒宿主菌DNase活性没有去除干净，从中纯化的质粒DNA将会有更多nick。

二、质粒DNA修复（20L体系，此步不可跳过）
7.质粒预处理可以修复单链上的nick，提高突变效率。
成分                                    加入量
质粒DNA模板                       1 g
10×质粒DNA修复反应液       2 L
质粒DNA修复酶                    2 L
补超纯水到终体积                20 L
37℃保温2小时，72℃灭活酶

三、质粒DNA修复（20L体系）
8.按下表设置两个PCR反应：
成分                                               1号管       2号管
上步所得修复后的质粒DNA      0.1-0.5 g       0.1-0.5 g
2×超保真PCR MasterMix                10 L         10 L
自备引物一(10 M)                              1 L        不加
自备引物二(10 M)                            不加        1 L
补超纯水到终体积                            20 L        20 L
9.放入PCR仪器中按下面参数进行PCR：
                                 温度    时间     循环数
变性                         98℃    3分钟      1次
PCR
（注：只18次循环）98℃     40秒      18次
                                60℃     1分钟    
                               72℃     30秒/Kb（质粒DNA长度）    
延伸                        72℃    10分钟       1次
保存                         4℃    长时间保持    

四、DNA复性：
10.PCR反应后，将两管DNA反应液汇集在一起，共40 L。
11.加入2L质粒处理液，混匀后37℃孵育2小时。
12.处理后的反应液可以直接用于细菌转化，或者放-20℃保存备用。

五. 转化、挑克隆鉴定：
13.用1-5 L上步所得反应液转化100L感受态细菌（转化效率必须在10E7/g以上）。转化流程可以参考分子克隆手册。通常会得到50个以下的克隆，95%是所需要的突变。

六、常见问题：
14.转化后没有克隆或克隆数极少：a、感受态细菌效率不够高，请检测一下感受态细胞的效率，确保转化效率在10E7转化子/g。b、把质粒处理液处理后的产物全部用常规的乙醇沉淀法沉淀，再溶解在5L超纯水中，全部用于转化。C、质粒DNA放置太久或宿主菌DNase活性高，使得携带的nick比较多，没能彻底修复。

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